賈國濤 張俊嶺 魏壯狀 袁岐山 王寶林 王曉瑜 馬勝濤楊欣玲 張子穎 張世英 賈世偉 陳 洋 劉惠民

（1河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，450000，河南鄭州；2中國煙草總公司鄭州煙草研究院，450001，河南鄭州）

煙葉是我國卷煙工業(yè)的原料基礎(chǔ)，不同區(qū)域煙葉質(zhì)量風(fēng)格特征存在明顯差異，其中煙葉游離氨基酸含量與煙葉風(fēng)格特征有密切的關(guān)系，游離氨基酸作為煙草中一類重要的致香前體物質(zhì)，其含量影響煙草的味道和煙氣的豐滿度[1-2]。在煙草調(diào)制、醇化或發(fā)酵加工直至燃燒的過程中，游離氨基酸與還原糖（或羰基化合物）之間發(fā)生酶催化及非酶催化的棕色化反應(yīng)，生產(chǎn)多種具有烤香或爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯和吡啶類等雜環(huán)化合物[3-4]，某些氨基酸（如苯丙氨酸）還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇和苯乙醇等[5]，這些物質(zhì)對(duì)不同區(qū)域烤煙香型風(fēng)格的形成有重要作用[6]?？緹熡坞x氨基酸含量的區(qū)域特征研究對(duì)烤煙的香型風(fēng)格區(qū)劃、卷煙配方設(shè)計(jì)和煙葉資源的合理利用均有一定的理論意義和實(shí)用價(jià)值。近年來，眾多學(xué)者對(duì)多樣品、多指標(biāo)的品質(zhì)進(jìn)行了應(yīng)用因子分析和聚類分析，王鵬澤等[7]采用因子、聚類及判別分析相結(jié)合的方法，對(duì)河南省31個(gè)產(chǎn)煙縣的169個(gè)煙葉樣品的風(fēng)格特征指標(biāo)進(jìn)行了分析。李瑞麗等[8]以32個(gè)植煙縣的89個(gè)烤煙樣品為研究對(duì)象，對(duì)葉片厚度、葉面密度、填充值、陰燃時(shí)間、抗張強(qiáng)度和平衡含水率等物理指標(biāo)進(jìn)行了因子分析和聚類分析。薛超群等[9]以43個(gè)產(chǎn)地的煙葉，分析了底色、厚度、蠟質(zhì)感、柔韌性、葉面葉背顏色差、葉尖葉基身份差、光澤和葉面組織等15項(xiàng)外觀特征指標(biāo)，采用主成分分析法提取了7個(gè)主成分，并對(duì)43個(gè)產(chǎn)地?zé)熑~進(jìn)行聚類。目前用其分析不同區(qū)域烤煙游離氨基酸含量的研究則鮮見報(bào)道。因此，本研究以不同區(qū)域烤煙游離氨基酸含量為變量，采用因子分析和聚類分析方法對(duì)不同區(qū)域烤煙游離氨基酸含量進(jìn)行分析和科學(xué)分類，并為特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)和工業(yè)企業(yè)采購原料提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗(yàn)材料來自中國煙草總公司鄭州煙草研究院，為2018年煙葉原料樣品，來自17個(gè)省份56個(gè)地區(qū)（詳見表1）的168份樣品，煙葉等級(jí)為C3F。

表1 烤煙材料產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of flue-cured tobacco materials

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

不同產(chǎn)地C3F等級(jí)樣品分別取30片，對(duì)煙葉樣品進(jìn)行去梗、烘干和粉碎處理，然后過60目篩。煙葉中游離氨基酸用鹽酸調(diào)節(jié)的檸檬酸鋰緩沖液萃取，使用氨基酸分析儀（型號(hào)：Biochrom 30，英國Biochrom公司）測(cè)定[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、SPSS 22.0和R語言（R-4.0.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙游離氨基酸含量描述性統(tǒng)計(jì)分析

由表2可知，烤煙游離氨基酸均值總量為12 054.52μg/g，范圍為 7559.54～23 460.83μg/g。其中脯氨酸（Pro）含量最高（8342.26μg/g），其次為天冬酰胺（Asn）（777.29μg/g），蛋氨酸（Met）含量最低（4.49μg/g）。21種烤煙游離氨基酸含量整體表現(xiàn)為Pro＞Asn＞谷氨酰胺（Gln）＞丙氨酸（Ala）＞纈氨酸（Val）＞絲氨酸（Ser）＞天冬氨酸（Asp）＞谷氨酸（Glu）＞氨基丁酸（4-Gaba）＞色氨酸（Trp）＞苯丙氨酸（Phe）＞組氨酸（His）＞半胱氨酸（Cys）＞酪氨酸（Tyr）＞蘇氨酸（Thr）＞精氨酸（Arg）＞甘氨酸（Gly）＞賴氨酸（Lys）＞亮氨酸（Leu）＞異亮氨酸（Ile）＞Met。從變異系數(shù)看，烤煙游離氨基酸變異系數(shù)處于13.35%～75.94%。其中Asn、Glu、Gln、Phe、Lys和His變異系數(shù)均大于50%，Val變異系數(shù)最?。?3.35%），其次為Ala（17.33%）。

表2 烤煙游離氨基酸含量描述統(tǒng)計(jì)Table 2 Descriptive statistics of free amino acid contents in flue-cured tobacco

2.2 對(duì)烤煙游離氨基酸的相關(guān)性分析

如圖1所示，Ser與Val含量存在極顯著正相關(guān)，與其他氨基酸無顯著關(guān)系。Val與Ser和Gys含量存在極顯著正相關(guān)，與His和Pro含量存在極顯著和顯著負(fù)相關(guān)，與其他氨基酸無顯著關(guān)系。Gys與Val、Asp、Ile、Lys和Arg含量均存在極顯著正相關(guān)，與Asn、Gln、Met、Tyr和Phe含量均存在顯著正相關(guān)。Met與Cys和Ile含量存在顯著正相關(guān)。其他游離氨基酸相關(guān)系數(shù)大部分達(dá)到顯著水平?？緹熡坞x氨基酸間較強(qiáng)的相關(guān)性說明，可以通過主成分分析研究烤煙游離氨基酸間的復(fù)雜關(guān)系。

圖1 烤煙游離氨基酸相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of free amino acids in flue-cured tobacco

2.3 不同區(qū)域烤煙游離氨基酸含量的熱圖分析

熱圖是近年來被廣泛應(yīng)用的一種統(tǒng)計(jì)方法，可以簡(jiǎn)單地聚合大量數(shù)據(jù)，將結(jié)果以一種漸進(jìn)色帶直觀地展現(xiàn)出來，可看出數(shù)據(jù)的疏密和頻率高低程度。17個(gè)省份56個(gè)地區(qū)21種游離氨基酸含量分析結(jié)果（圖2）顯示，平頂山和漯河地區(qū)烤煙Trp、His、Phe、4-Gaba和Asn含量高，寶雞、延安和丹東地區(qū)烤煙Trp含量低，長(zhǎng)沙、韶關(guān)、吉安、龍巖和南平地區(qū)烤煙Gln含量低，不同地區(qū)間烤煙Asp、Asn、Glu和Gln含量差異明顯。

圖2 不同區(qū)域烤煙游離氨基酸含量的熱圖分析Fig.2 Heatmap analysis of free amino acid content in flue-cured tobacco in different regions

2.4 烤煙游離氨基酸含量的因子分析

對(duì)21種烤煙游離氨基酸進(jìn)行因子分析，結(jié)果見表3。公因子提取方法采用主成分分析法，公因子（主成分）數(shù)目選定既要滿足數(shù)據(jù)降維目的，又要綜合大部分的信息，常用累積方差貢獻(xiàn)率不低于85%來確定公因子數(shù)目，故本研究選擇5個(gè)公因子，累積方差貢獻(xiàn)率為86.81%，表明5個(gè)主成分構(gòu)成的信息能夠反映原來變量的大部分信息。

由表3和表4可知，因子1特征值為12.34，主要綜合了Thr、Asn、Glu、Gln、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Trp和Arg的信息；因子2特征值為2.33，主要綜合了Val和Cys的信息；因子3特征值為1.43，主要綜合了Ser的信息；因子4特征值為1.18，主要綜合了Ala和4-Gaba的信息；因子5特征值為0.95，主要綜合了Met的信息。由于因子1累積貢獻(xiàn)率（58.74%）大于50%，因此認(rèn)為，Thr、Asn、Glu、Gln、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Trp和Arg是烤煙的特征游離氨基酸。

表3 主成分分析的特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalue and variance contribution rate of principal component analysis

表4 主成分分析的載荷矩陣Table 4 Load matrix of principal component analysis

應(yīng)用各個(gè)因子的載荷量和特征值計(jì)算出每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的得分值、排名及綜合主成分值，由表5可知，Z1得分值越大，排名越靠前，表明烤煙的Thr、Asn、Glu、Gln、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Trp和Arg含量越高，排名前5位的地區(qū)依次為漯河、平頂山、洛陽、普洱和銅仁；Z2得分值越大，排名越靠前，表明烤煙Val和Gys的含量越高，排名前5位的地區(qū)依次為哈爾濱、丹東、銅仁、長(zhǎng)春和牡丹江；Z3得分值越大，排名越靠前，表明烤煙Ser的含量越高，排名前5位的地區(qū)依次為大理、保山、普洱、昆明和宜昌；Z4得分值越大，排名越靠前，表明烤煙Ala和4-Gaba的含量越高，排名前5位的地區(qū)依次為宜賓、洛陽、濰坊、銅仁和湘西；Z5得分值越大，排名越靠前，表明烤煙Met的含量越高，排名前5位的地區(qū)依次為銅仁、許昌、賀州、畢節(jié)和文山。綜合得分排前10名的地區(qū)由高到低依次為漯河、平頂山、洛陽、普洱、銅仁、哈爾濱、臨沂、湘西、百色和濰坊。

表5 不同區(qū)域烤煙游離氨基酸的主成分得分Table 5 Principal component scores of free amino acids in flue-cured tobacco from different regions

2.5 烤煙游離氨基酸含量的聚類分析

對(duì)56個(gè)地區(qū)烤煙樣品進(jìn)行K均值聚類分析，結(jié)果見圖3和表6。樣品分為3類，第1類包括玉溪、昆明、曲靖、普洱、臨滄、瀘州、宜賓、銅仁、武隆、宜昌、湘西、百色、宣城、許昌、洛陽、三門峽、安康、漢中、濰坊、臨沂、丹東、長(zhǎng)春、牡丹江和哈爾濱24個(gè)產(chǎn)地的樣品，此類樣品烤煙游離氨基酸總量適中，總量均值為12 861.4μg/g，其中Ser和Val含量高。第2類包括大理、紅河、文山、保山、昭通、涼山、黔西南、遵義、畢節(jié)、黔南、巫山、恩施、襄陽、郴州、永州、長(zhǎng)沙、邵陽、韶關(guān)、賀州、贛州、撫州、吉安、三明、龍巖、南平、駐馬店、南陽、商洛、寶雞和延安30個(gè)產(chǎn)地的樣品，烤煙游離氨基酸總量最低，總量均值為 10 712.02μg/g，其中Asp、Thr、Asn、Glu、Gln、Gly、Ala、Cys、Leu、Tyr、Phe、4-Gaba、Lys、His、Trp和Arg含量顯著低于其他2個(gè)類群。第3類包括平頂山和漯河2個(gè)產(chǎn)地的樣品，烤煙游離氨基酸總量最高，總量均值為22 509.41μg/g，除了Ser、Met和Ile，其他烤煙游離氨基酸含量與另外2個(gè)類群均存在顯著性差異。

表6 3個(gè)類群烤煙游離氨基酸含量分析Table 6 Analysis of free amino acid content in three groups of flue cured tobacco μg/g

圖3 不同區(qū)域烤煙游離氨基酸含量聚類分析Fig.3 Cluster analysis of free amino acids content of flue cured tobacco in different regions

3 討論

氨基酸是煙草中的一類重要化學(xué)物質(zhì)，是組成蛋白質(zhì)的主要成分，同時(shí)也是合成煙堿和多酚等有關(guān)物質(zhì)的前提，對(duì)煙株體內(nèi)氮的代謝及煙葉品質(zhì)具有重要作用[11]。烤煙游離氨基酸總量范圍為7559.54～23 460.83μg/g，其中 Pro、Asn、Gln、Ala和Val含量較高。陳文等[12]研究了我國東北、山東、福建和云南的烤煙游離游離氨基酸含量，其中Pro、Ala、Asn、Arg、Asp和Phe是主要的6種氨基酸。史宏志等[13]研究表明，烤煙中水解氨基酸含量較高的是Glu、Asp、Pro、Ala、Val、Gly和Phe，約占總含量的70%，本研究結(jié)果與其基本一致。對(duì)烤煙游離氨基酸進(jìn)行相關(guān)性分析表明，除了Val、Ser、Cys和Met相關(guān)性不顯著，其他烤煙游離氨基酸均存在顯著相關(guān)性。

因子分析在最大可能保留原有指標(biāo)性狀信息的前提下，用少數(shù)且彼此相關(guān)性低的指標(biāo)代替原有較多且彼此相關(guān)性高的指標(biāo)，從而簡(jiǎn)化多指標(biāo)分析[14]，從而得到綜合信息。基于21種烤煙游離氨基酸，本研究對(duì)17個(gè)省份56個(gè)地區(qū)烤煙游離氨基酸進(jìn)行主成分分析，提取前5個(gè)成分作為主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)86.81%，這些因子綜合反映了21種烤煙游離氨基酸的絕大部分信息。殷延齊等[15]對(duì)煙絲中游離態(tài)氨基酸研究分析，第1主成分的特征值為9.28，累計(jì)貢獻(xiàn)率為51.56%，其中Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、Val和Lys反映了第1主成分煙絲氨基酸的主要信息，與本研究結(jié)果基本一致。

聚類分析是應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析原理研究分類問題的一種數(shù)學(xué)方法，主觀因素少，分類結(jié)果客觀且科學(xué)，并同時(shí)對(duì)大量性狀進(jìn)行綜合考察[16-18]。本研究將56個(gè)地區(qū)烤煙樣品分為3個(gè)類群，第1類群主要以清香型產(chǎn)區(qū)為主。董洪旭等[19]研究表明，清香型產(chǎn)區(qū)的Ser和Val含量顯著高于濃香型和中間香型產(chǎn)區(qū)，與本研究結(jié)果一致。第2類群主要以中間香型產(chǎn)區(qū)為主，其中Asp、Asn、Glu、Gly、Tyr、Phe、Lys和Trp含量顯著低于其他2個(gè)類群，中間香型產(chǎn)區(qū)游離氨基酸含量顯著低于清香型和濃香型產(chǎn)區(qū)[19]。第3類群為平頂山和漯河產(chǎn)地，烤煙游離氨基酸總量最高。

4 結(jié)論

烤煙游離氨基酸總量范圍為7559.54～23 460.83μg/g，其中 Pro、Asn、Gln、Ala 和 Val含量較高。除了Val、Ser、Cys和Met含量相關(guān)性不明顯，其他烤煙游離氨基酸均存在顯著相關(guān)性。主成分分析選擇5個(gè)公因子，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.81%，表明5個(gè)主成分構(gòu)成的信息能夠反映原來變量的大部分信息。對(duì)56個(gè)地區(qū)烤煙樣品進(jìn)行K均值聚類分析，可分為3個(gè)類群。通過對(duì)不同區(qū)域烤煙游離氨基酸的研究，為煙葉生產(chǎn)種植的合理區(qū)劃及特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。