劉 慧 劉博遠(yuǎn) 金明珂 陽葦麗 張思唯 趙銘欽

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，450003，河南鄭州；2四川省煙草公司達(dá)州市公司，635000，四川達(dá)州）

相關(guān)研究[1-2]表明，海拔高度的變化能夠引起太陽輻射量、有效積溫、晝夜溫差以及空氣濕度等條件的改變，是影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量的重要生態(tài)因素之一，其對煙葉生長發(fā)育的影響程度明顯高于土壤類型和土壤理化性狀等生態(tài)因子。

煙葉中香氣物質(zhì)的種類繁多，并且大多數(shù)的含量極低，煙葉的香氣物質(zhì)包括致香物質(zhì)和致香前體物質(zhì)[3]。根據(jù)形成香氣物質(zhì)的途徑，將煙葉中能產(chǎn)生香氣的前體物劃分為色素、多酚、有機(jī)酸和生物堿等[4]。這些致香前體物質(zhì)會在煙葉的生長、成熟、調(diào)制及陳化過程中轉(zhuǎn)化和降解成能夠直接影響烤煙風(fēng)味的香氣物質(zhì)[5]。其中多酚和有機(jī)酸在煙葉燃燒過程中能夠中和酸堿度，改善吃味，使煙吸味醇和，增加煙氣濃度，間接影響烤煙的抽吸品質(zhì)和香氣味，同時(shí)為煙葉的品質(zhì)及可用性提供參考依據(jù)[6-9]。煙葉中的色素主要包括葉綠素（葉綠素a和葉綠素b）和類胡蘿卜素（紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素）[10]，其在吸味、煙氣安全性、顏色和香氣等方面影響煙草的品質(zhì)，在調(diào)制和陳化過程中，葉綠素會降解成具有青果香味的新植二烯和陳化煙香的吡咯類化合物，而類胡蘿卜素會降解為酮類等重要的致香成分[11]。生物堿是由煙株根系在數(shù)種酶的催化下合成后輸送至煙葉內(nèi)儲存的，主要影響煙氣的濃度和勁頭。劉鵬飛等[12]研究表明，綠原酸和莨菪亭含量占多酚類物質(zhì)總量的比例與海拔高度呈負(fù)相關(guān)和極顯著負(fù)相關(guān)，而蕓香苷含量隨著海拔的升高而升高，并且表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)，高海拔有利于提高多酚類物質(zhì)含量[13]。王淼等[14]和楊志曉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高海拔條件下具有較高含量的葉黃素，且葉綠素a/葉綠素b和葉綠素/葉黃素比值也較大，但色素含量因品種及部位不同而異[13]。隨緯度降低和海拔升高，年有效積溫、年日均溫、種植期均溫和無霜期對類胡蘿卜素降解產(chǎn)物均有促進(jìn)作用[16-17]。但生物堿變化趨勢與多酚色素多有不同，研究[18-20]表明，海拔升高導(dǎo)致的晝夜溫差及太陽輻射量的改變導(dǎo)致煙堿含量隨海拔的升高呈極顯著下降的趨勢，但隨著海拔的升高，其降幅減緩。簡永興等[1]通過對不同海拔對烤煙生物堿組成的研究得出，適當(dāng)提高種植海拔，有利于提高烤煙煙堿所占百分率，降低微量生物堿所占百分率，從而降低煙氣的刺激性，提高烤煙品質(zhì)。王樹會等[21]研究發(fā)現(xiàn)，煙葉中總有機(jī)酸含量在1400～1600m海拔時(shí)較高，而在1200～1400m海拔時(shí)最低。也有研究[22-23]指出，1800m海拔條件下高級脂肪酸含量較高，1500m海拔下有機(jī)酸總量最高，1300m海拔時(shí)有機(jī)酸含量適中，1050～1300m海拔下非揮發(fā)性有機(jī)酸總量高于950～1150m海拔。

目前，有關(guān)雪茄煙的栽培生理和晾制條件等研究較多，但關(guān)于海拔對雪茄煙致香前體物質(zhì)的影響鮮見報(bào)道。本研究分析四川省達(dá)州萬源地區(qū)雪茄煙中致香前體物質(zhì)含量與海拔的關(guān)系，以期為特色優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在四川省達(dá)州市萬源縣河口鎮(zhèn)進(jìn)行，3個(gè)不同海拔梯度煙田分別是1301（高）、941（中）和798m（低）。該地區(qū)生育期內(nèi)日均溫度20.80℃，平均溫差10.18℃，≥10℃積溫1852.94℃，日照時(shí)數(shù)443.73h，平均相對濕度70.84%，降雨量480.33mm。試驗(yàn)地土質(zhì)均為紫色土。

1.2 試驗(yàn)材料

供試品種為川雪1號，于2019年4月30日進(jìn)行移栽，行距120cm，株距40cm。在每個(gè)海拔分別設(shè)置6個(gè)采樣區(qū)，上部葉和中部葉分別取1kg，共計(jì)36份樣品。田間管理同常規(guī)雪茄煙生產(chǎn)，煙葉適熟采收，采用統(tǒng)一晾房進(jìn)行晾制。

1.3 測定指標(biāo)及方法

參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，采用液相色譜法對樣品中的類多酚成分含量[24]及質(zhì)體色素類化合物含量[25]進(jìn)行測定。

準(zhǔn)確稱取0.10g煙草粉末，置于15mL具塞試管中，配制己二酸內(nèi)標(biāo)溶液100μL，倒入具塞試管中與樣品充分搖勻。再加入10%（體積分?jǐn)?shù)）硫酸-甲醇溶液2mL，振蕩5min，室溫放置過夜，進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，然后加去離子水和二氯甲烷各5mL，萃取3次，采用硫酸甲酯化-氣相色譜測定煙葉中揮發(fā)性有機(jī)酸含量。

將樣品于50℃烘干后粉碎，過250μm篩。每個(gè)樣品稱200mg煙末，置于15mL旋蓋培養(yǎng)試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（7.5μg/μL正十六烷內(nèi)標(biāo)溶液）100μL、10%NaOH溶液1.5mL和甲基叔丁基3.0mL，旋緊旋蓋，充分振蕩5min，室溫放置（24±2）h后提取上層清液，通過Agilent7890A型氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（美國Agilent Technologies公司）定量分析4種生物堿（煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿）的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019、SPSS 24.0及DPS 6.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海拔對雪茄煙多酚含量的影響

如表1所示，隨著海拔的升高，多酚含量整體呈升高趨勢，且中部葉和上部葉變化趨勢相近，以高海拔多酚含量最高，高于或顯著高于中、低海拔，中、低海拔間沒有顯著差異；各指標(biāo)間以云香苷含量最高，綠原酸和莨菪亭含量較低。高海拔上部葉和中部葉多酚總含量分別較低海拔增加61.17%和65.70%。

表1 海拔對雪茄煙多酚含量的影響Table 1 Effects of altitude on polyphenol content of cigar mg/g

2.2 海拔對雪茄煙色素含量的影響

由表2可知，隨海拔的升高，晾制后雪茄煙葉中葉黃素與β-胡蘿卜素含量呈上升趨勢，高海拔上部葉葉黃素及β-胡蘿卜素含量較低海拔增加12.05%和29.43%，中部葉與上部葉變化趨勢相近，高海拔葉黃素及β-胡蘿卜素含量較低海拔增加32.95%和21.46%。煙葉中葉綠素含量變化恰好與葉黃素和β-胡蘿卜素含量相反，隨著海拔的升高葉綠素含量顯著下降（P＜0.05），其中高海拔上部葉葉綠素含量較低海拔下降92.35%，中部葉葉綠素含量下降45.12%。

表2 海拔對雪茄煙色素的影響Table 2 Effects of altitude on pigment of cigar μg/g

2.3 海拔對雪茄煙有機(jī)酸含量的影響

由表3可知，隨海拔升高，草酸、丙二酸、蘋果酸、檸檬酸及總有機(jī)酸含量均呈一致的變化趨勢，且高海拔與中、低海拔間大部分差異顯著。高海拔與中、低海拔相比，上部葉草酸含量分別增加了40.45%和46.09%，丙二酸含量分別增加了25.33%和30.85%，蘋果酸含量分別增加了17.76%和24.41%，檸檬酸含量分別增加了13.54%和30.90%，有機(jī)酸總量分別增加了20.43%和29.80%。中部葉與上部葉的變化趨勢相近，表明隨著海拔升高，環(huán)境因素的改變，煙葉有機(jī)酸含量發(fā)生一定規(guī)律性變化。

表3 海拔對雪茄煙主要有機(jī)酸含量的影響Table 3 Effects of altitude on the contents of main organic acids in cigar mg/g

2.4 海拔對雪茄煙生物堿含量的影響

如表4所示，上、中部煙葉晾制后煙葉的總生物堿含量整體上隨種植海拔的上升而顯著下降（P＜0.05），上部葉和中部葉高、中、低海拔生物堿總含量分別為8.75%、7.00%及4.12%，隨葉位由下而上逐步增加。5種生物堿在不同海拔間大部分存在顯著差異，其中中、低海拔煙堿、降煙堿、麥思明和生物堿總含量顯著高于高海拔，假木賊堿和新煙草堿含量在大部分海拔間差異不顯著。在5種生物堿中，煙堿含量最高，降煙堿次之，麥思明最低。

表4 海拔對雪茄煙生物堿含量的影響Table 4 Effects of altitude on alkaloid content in cigar %

2.5 海拔與致香前體物質(zhì)灰色關(guān)聯(lián)度分析

以海拔為參考數(shù)列，各致香物質(zhì)含量為比較數(shù)列，計(jì)算關(guān)聯(lián)度（表5）。由表5可知，上部葉各致香前體物質(zhì)指標(biāo)與海拔的關(guān)聯(lián)度順序?yàn)槎喾樱旧飰A＞色素＞有機(jī)酸；中部葉各致香前體物質(zhì)指標(biāo)與海拔的關(guān)聯(lián)度順序?yàn)槎喾樱旧兀居袡C(jī)酸＞生物堿?？傮w來說，海拔對多酚影響最大（關(guān)聯(lián)度排序第1位）；就上部葉來看，海拔對生物堿影響也較大；海拔對中部葉各指標(biāo)的影響程度中多酚影響程度最大，色素次之，生物堿最小。

表5 海拔與致香前體物質(zhì)關(guān)聯(lián)度及排序Table 5 Correlation between altitude and aroma precursors

3 討論

煙草酚類物質(zhì)包括酚及其衍生物，在煙草生長和調(diào)制過程中有著重要的作用[26]，是評價(jià)煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)。當(dāng)煙株處于不良環(huán)境時(shí)，煙株體內(nèi)調(diào)控酚類物質(zhì)生物合成的酶活性升高，酚類物質(zhì)的積累增加抵抗不利環(huán)境因素[27]，如本研究中隨著海拔的升高，光照強(qiáng)度及紫外線明顯增強(qiáng)，為了免受強(qiáng)紫外線輻射傷害，植物啟動逆境反饋機(jī)制，加速誘導(dǎo)酚類物質(zhì)合成，吸收紫外線和消除因呼吸作用和光合作用產(chǎn)生的自由基[28]，引起多酚含量增加。朱小茜等[29]研究發(fā)現(xiàn)，損失紫外光區(qū)的光線會導(dǎo)致煙葉多酚含量及多酚氧化酶活性降低。相應(yīng)地，海拔越高，多酚類化學(xué)物含量就越高，與本研究結(jié)果一致。

質(zhì)體色素（葉綠素、類胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物）對煙葉的質(zhì)量有重要影響[30]。本研究結(jié)果表明，高海拔區(qū)域葉綠素含量較低，但類胡蘿卜素（葉黃素和β-胡蘿卜素）含量呈升高的趨勢。由此看出，隨著海拔的升高，植物葉片中的葉綠素含量呈降低的變化趨勢[15]，由于葉綠素含量下降，能夠減少葉片對光能的大量吸收，從而使植物免受強(qiáng)光照輻射的損傷。在其他植物中也發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律[31-33]。類胡蘿卜素在植物體內(nèi)具有重要保護(hù)功能[16]，具體原理為，一方面，類胡蘿卜素分子中的共軛雙鍵可以強(qiáng)烈吸收紫外光譜區(qū)域的輻射，通過增加葉片表皮層中紫外吸收物質(zhì)含量來影響紫外線輻射的穿透性，減少進(jìn)入葉肉組織的紫外線輻射量，避免葉綠素的光氧化；另一方面，通過直接吸收紫外線輻射，從而減少紫外線對植物的傷害，尤其是對光合系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ的破壞[34-35]。且高海拔地區(qū)光照強(qiáng)烈、晝夜溫差大可促進(jìn)類胡蘿卜素積累[36]，此結(jié)論與王京等[37]和韓錦峰等[38]的研究結(jié)果一致。但超過一定海拔，質(zhì)體色素及其降解產(chǎn)物含量會隨海拔升高而降低[39]。

有機(jī)酸類物質(zhì)是植物生長發(fā)育過程中含氮化合物和碳水化合物代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，也是呼吸作用中三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。本研究結(jié)果表明，高海拔煙葉有機(jī)酸含量顯著高于中、低海拔，由于上部葉位置較高，光照充足，利于光合作用積累，有機(jī)酸含量整體上表現(xiàn)為上部葉＞中部葉，高海拔＞中海拔＞低海拔，此結(jié)論與前人[40-41]研究結(jié)果相一致。但簡永興等[42]研究發(fā)現(xiàn)，烤煙云煙87的草酸及檸檬酸含量均隨海拔的上升而下降，王育軍等[43]認(rèn)為，大田期5月、8月和9月平均晝夜溫差增加，會顯著或極顯著引起煙葉蘋果酸、檸檬酸和有機(jī)酸總量的降低，此結(jié)論與本研究結(jié)果略有不同，可能是海拔超過一定高度后有機(jī)酸變化規(guī)律會發(fā)生改變，或因雪茄煙與烤煙類型間差異造成。

生物堿由煙株根系在數(shù)種酶的催化下合成后輸送至煙葉內(nèi)儲存[44-45]。本研究結(jié)果顯示，煙葉的煙堿含量隨種植海拔升高而下降，與簡永興等[42]研究結(jié)果相似。海拔升高改變了太陽輻射量、有效積溫、晝夜溫差和空氣濕度等生態(tài)因子，這些改變可促使根系煙堿合成酶活性下降，使煙株對土壤氮素的吸收能力下降，從而降低煙堿的合成速度[42]。且另一方面隨海拔升高，土壤溫度下降，使得煙株根系催化生物堿合成酶的活性下降，從而使得生物堿合成速度減慢[45-46]。同時(shí)，海拔升高導(dǎo)致的晝夜溫差及太陽輻量的改變也可能對生物堿合成起到了一定的阻礙作用[47]，最終導(dǎo)致生物堿總含量隨種植海拔的上升而下降。

綜上所述，適當(dāng)提高雪茄煙種植海拔，可以降低葉綠素含量，減輕煙葉燃吸時(shí)產(chǎn)生的青雜氣[30]；提高類胡蘿卜素和非揮發(fā)性有機(jī)酸含量，類胡蘿卜素可降解成為香味閾值雖低但香氣質(zhì)較好的香味物質(zhì)，非揮發(fā)性有機(jī)酸可在煙葉燃燒過程中中和酸堿度，改進(jìn)吃味，使煙吸味醇和；增加生物堿，可提高煙氣濃度，間接影響煙葉的抽吸品質(zhì)和香氣味[6-9]。因此，適當(dāng)提高種植海拔可在一定程度上改善煙葉品質(zhì)。

4 結(jié)論

海拔對致香前體物質(zhì)具有一定的影響。葉綠素與生物堿隨海拔升高呈下降的趨勢，多酚、類胡蘿卜素及有機(jī)酸含量隨著海拔升高而逐漸升高。由灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果看出，海拔與致香前體物質(zhì)各指標(biāo)關(guān)聯(lián)度不同，且不同部位影響程度也不盡相同，整體來看，對多酚含量影響較大，對有機(jī)酸含量影響較小。綜合分析，適當(dāng)提高種植海拔可以使雪茄煙抽吸時(shí)香味物質(zhì)更濃郁。