李瑞琪 畢浩然 姜恭好 段海燕

（1黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，150080，黑龍江哈爾濱；2黑龍江大學生命科學學院，150080，黑龍江哈爾濱）

培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性高和廣適性強的水稻品種是現(xiàn)在水稻育種工作的重要目標[1]?？沼?31是黑龍江省的主要水稻栽培品種，其生育期較短，具有結(jié)實率高、耐冷害能力強、田間抗性強、出米率高和米質(zhì)優(yōu)等諸多優(yōu)良性狀[2]。對該品種進行持續(xù)的遺傳改良，補足品種短板，繼續(xù)發(fā)揮品種的優(yōu)異環(huán)境適應性，對黑龍江省的水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

稻瘟病是一種水稻真菌性病害，每年都會造成嚴重的糧食產(chǎn)量損失[3]。近年來，由于稻瘟病生理小種的變化，空育131在黑龍江省的稻瘟病抗性嚴重退化，在生產(chǎn)上表現(xiàn)為抗性差和抗譜窄。經(jīng)過鑒定，空育131本身攜帶Pik和Pia稻瘟病抗性基因[4]，但不能滿足黑龍江省當前稻瘟病抗性育種的需要，迫切需要引入新的具有廣譜抗性的基因。另外，由于空育131的稻米不具有香味，與當下對香米市場的需求不相適應，也有必要通過分子育種的手段對這2個性狀加以改良。

Pi1是位于第11號染色體上的來源于利比亞粳型品種LAC23的廣譜稻瘟病抗性基因[5]。Pi2是位于第6號染色體上的來源于秈稻品種5173的高抗稻瘟病基因[6]。Pi9同樣是位于第6號染色體上的來源于小粒野生稻（Oryza minuta）的抗稻瘟病基因[7]，它對來自13個國家的43個稻瘟病菌株都表現(xiàn)出了很高的抗性[8]。Pi2和Pi9都被認為在水稻抗稻瘟病實踐中具有較高的利用價值。位于水稻第8號染色體上的Osbadh2（LOC＿Os08g32870）是一個重要的香味調(diào)控基因[9]。Osbadh2基因不同部位的缺失或插入會導致該基因功能喪失，分泌出香味物質(zhì)2-乙?；?吡咯啉（2AP），使稻米產(chǎn)生香味[10]，fgr是編碼甜菜醛脫氫酶（OsBADH2）的Osbadh2基因的隱性突變等位基因，導入該基因可以使稻米產(chǎn)生濃郁的香味品質(zhì)[11-12]。

本研究采用基因聚合育種的方法，利用以上4個（Pi1、Pi2、Pi9和fgr）基因?qū)沼?31的香味品質(zhì)和稻瘟病抗性2個性狀進行遺傳改良，為培育食味品質(zhì)和抗病能力都有所加強的新空育131提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗將來源于4個供體的1個香味基因和3個抗稻瘟病基因，即DHX2（fgr）和HLJ2（Pi1）、HLJ7（Pi2）、HLJ16（Pi9）分別導入空育131中，再將香味基因改良系KY（fgr）與稻瘟病抗性基因改良系KY（Pi1）、KY（Pi2）和KY（Pi9）分別雜交，其雜交組合為Pi1+fgr、Pi2+fgr和Pi9+fgr。以野生型空育131（KY131）作對照，對雜交F2和F3代通過分子標記PCR進行基因型篩選鑒定。fgr所用引物為BadF4和BadR4；Pi1所用引物為RM27322-F和RM27322-R；Pi2所用引物為L11-F和L11-R；Pi9所用引物為L7-F和L7-R。引物序列均由華中農(nóng)業(yè)大學何予卿老師提供。并對篩選出的F3代株系進行香味特征與稻瘟病抗性驗證。

利用RCIE6K芯片（中國種子集團有限公司）對所獲得的遺傳材料進行背景分析。RICE6K芯片是基于全基因組單核苷酸多態(tài)性（SNP）陣列原理，根據(jù)520份世界微核心水稻種質(zhì)資源測序的結(jié)果，總共包含獲得5636個SNP標記（包含少量的InDel插入/缺失標記），經(jīng)過合成和測試，最終有4473個高質(zhì)量標記具有良好的基因分型效果[13]。主要操作步驟包括DNA提取和PCR特異性擴增、擴增產(chǎn)物的片段化、芯片雜交、單堿基延伸、染色和掃描（由中國種子集團有限公司完成）。農(nóng)藝性狀調(diào)查，包括分蘗數(shù)、穗長、單穗粒數(shù)、單株粒重、千粒重和結(jié)實率。

采用混合蒸煮法驗證香味基因改良系KY（fgr）的香味品質(zhì)，將以上3種株系與野生型空育131的稻米進行不同比例的混合，蒸煮之后品嘗混合稻米的香味等級。采用苗期混合接種稻瘟病孢子的方法檢驗雙基因聚合株系對稻瘟病的抗性，用來自中國種子集團有限公司的稻瘟菌菌株分別接種Pi1+fgr、Pi2+fgr、Pi9+fgr以及感病對照KY131，觀察并記錄對稻瘟病的抗性等級。稻瘟病病情分級標準按照國際水稻研究所制定的稻瘟病抗性評價葉瘟分級標準[14]，共分為9級，從0級到9級病情逐漸加重。0級無病害癥狀；3級是葉片上出現(xiàn)小而圓以至稍長的褐色壞死灰斑，直徑1～2mm；4級是葉片上出現(xiàn)典型的稻瘟病斑或橢圓型病斑，長1～2cm，常限于2條葉脈間，病斑面積不足葉面積的2%；對照KY131為6級，表現(xiàn)為葉片上有典型的稻瘟病病斑，受害面積為10%～25%。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙基因聚合F2代基因型鑒定

F2代中每組選取200個單株，通過分子標記PCR最終篩選出21株雙基因聚合的純合單株。其中，KY（Pi1+fgr）植株6株，KY（Pi2+fgr）7株，KY（Pi9+fgr）8株，具體結(jié)果如表1和圖1所示。

表1 雙基因聚合F2代篩選結(jié)果Table 1 Identification pyramided genes of F2generation of double genes polymerization plants

圖1 雙基因聚合F2代PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The PCR identificationto of F2generation of double-gene polymerization individuals

2.2 雙基因聚合F3代香味基因驗證

由基因F2代篩選結(jié)果（表2）表明，具有香味基因fgr的KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）的改良系空育131已經(jīng)具有了香味品質(zhì)。隨著香味基因改良系KY（fgr）所占比例的增加，混合稻米的香味等級也不斷提升。

表2 雙基因聚合植株F3代香味品質(zhì)鑒定Table 2 Aroma quality appraisal of F3generation of double genes polymerization plants

2.3 雙基因聚合F3代稻瘟病抗性驗證

由表3可得，改良系KY（Pi1）、KY（Pi2）和KY（Pi9）均提高了水稻葉瘟的抗性等級，其中對水稻葉瘟的抗性有明顯提升作用的改良系是KY（Pi1）和KY（Pi2），相對于CK（KY131）均提升了3級；KY（Pi9）對稻瘟病的抗性提升了2級，改良系KY（Pi9）對水稻稻瘟病抗性的改良稍遜于KY（Pi1）和KY（Pi2）。

表3 雙基因聚合植株F3代稻瘟病抗性鑒定Table 3 Rice blast resistance identification of F3 generation of double genes polymerization plants

2.4 雙基因聚合的F3代基因芯片分析

由圖2可知，3種組合中大面積為透明區(qū)域，在第8號染色體上均有紅色區(qū)域，表明KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）在第8號染色體上與KY131存在純合差異位點，即香味基因fgr所在位點與KY131存在多態(tài)性。在KY（Pi1+fgr）組合中，第11號染色體上存在紅色區(qū)域，表明該組合中第11號染色體上與KY131存在差異位點，即稻瘟病抗性基因Pi1所在位點與KY131存在差異；在KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）組合中第6號染色體上存在紅色區(qū)域，表明在KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）的組合中，在第6號染色體上與KY131存在純合差異位點，即Pi2和Pi9所在的位點與KY131存在多態(tài)性。

圖2 雙基因聚合單株基因芯片分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of gene chip in double gene polymerization individuals

綜上可得，KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）、KY（Pi9+fgr）與KY131之間除目標基因外，只有部分基因位點與KY131存在多態(tài)性，其余基因位點都與KY131保持高度一致，實現(xiàn)了香味性狀與稻瘟病抗性的精準改良。

2.5 雙基因聚合的F3代農(nóng)藝性狀調(diào)查

由基因芯片分析結(jié)果可知，目標基因Pi1、Pi2、Pi9和fgr已成功聚合于KY131中，且Pi2、Pi9和fgr為純合聚合。親本材料為KY（Pi1）導入系、KY（Pi2）導入系、KY（Pi9）導入系和KY（fgr）導入系，除目標區(qū)段外，其余背景與野生型KY131一致，在F2代篩選出的雙基因純合株系在F3代仍是雙基因純合的情況，遺傳穩(wěn)定。對雙基因聚合KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和 KY（Pi9+fgr）株系進行農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果（表4和圖3）表明，雙基因聚合株系與KY131的各個農(nóng)藝性狀沒有明顯差異，說明改良型植株僅僅改變了目標性狀，其他性狀并未發(fā)生改變，雙基因聚合型KY131依然保留了野生型KY131自身的優(yōu)良性狀。

表4 雙基因聚合植株F3代農(nóng)藝性狀調(diào)查Table 4 Investigation of agronomic traits of F3generation in double-gene polymerization plants

圖3 雙基因聚合植株F3代農(nóng)藝性狀Fig.3 Agronomic traits of F3generation of double genes polymerization plants

3 討論

隨著種植環(huán)境和年份的變化，稻瘟病病菌很容易發(fā)生變異，連續(xù)多年種植單一抗性品種會導致抗性逐漸減退，甚至可能喪失[15]。近些年，水稻品種的稻瘟病抗性越發(fā)引起人們關(guān)注，已經(jīng)成為品種審定的一項標準[15]。KY131本身攜帶Pik和Pia基因，2003年之前在黑龍江省是比較抗病的品種。但目前，KY131在黑龍江省對稻瘟病抗譜窄、抗性差。本研究中與稻瘟病抗性相關(guān)的3個基因均具有廣譜抗性。導入上述3個基因的KY131的稻瘟病抗性分別提高了2～3級，其中Pi9提高了2級，Pi1和Pi2提高了3級。因此在水稻抗病育種中優(yōu)先選擇Pi1和Pi2基因效果更佳。

香味性狀是稻米品質(zhì)的重要評價指標，香稻育種成為現(xiàn)代水稻育種的重要方向之一[16]。本研究中選擇的水稻香味基因fgr來源于稻花香2號，結(jié)果表明，導入KY（fgr）香味基因的材料品質(zhì)也得到了提升。因此在水稻品質(zhì)改良中fgr基因可以有效地改善香味品質(zhì)，更好地提高稻米品質(zhì)。

基因聚合是將分子標記輔助選擇育種與傳統(tǒng)育種方式相結(jié)合的育種方式，利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記，對改良型目標群體進行基因型鑒定，可以精準地選擇目標基因，聚合多個目標基因，極大地縮短育種年限，提高育種效率，已成為目前育種工作中重要的方法[11,17]。本研究以水稻品種KY131為受體，用基因聚合的方法將抗病基因和香味基因聚合于KY131中，改良其抗稻瘟病抗性及香味特征，以達到延長優(yōu)良品種的利用年限，使其更加適應市場的需要。結(jié)果表明，基因聚合后的KY131的稻米具有香味，稻瘟病抗性也有效提高，農(nóng)藝性狀無明顯變化。基因聚合后的KY131具有寒區(qū)水稻種植資源推廣應用的可能性，可為選育、改良品質(zhì)和抗病效果更好的抗稻瘟病香稻品種提供資源信息和親本材料。

4 結(jié)論

將KY（fgr）分別與KY（Pi1）、KY（Pi2）、KY（Pi9）雜交，雜交親本均是KY131的改良系，遺傳背景相似度極高，避免了雜交過程中的連鎖累贅，增加了聚合育種的效率和遺傳背景的純凈度。將香味基因與稻瘟病抗性基因聚合于KY131中，得到了3種香味基因和抗病基因聚合的純合植株，基因型分別為Pi1+fgr、Pi2+fgr和Pi9+fgr，在改良系的后代植株中，香味品質(zhì)得到了大幅提升，對稻瘟病的抗性提高了2～3級，成功選育出了香型抗病的雙基因聚合改良系KY131，對水稻高品質(zhì)抗病育種具有重要的實踐意義。