馬 雙，游嘉德，巫端浩，江茉莉，周 琴，曹淑瑞*

（1．重慶化工職業(yè)學(xué)院 環(huán)境與質(zhì)量檢測(cè)學(xué)院，重慶 401228；2．西南政法大學(xué) 司法鑒定中心，重慶 401120；3．長(zhǎng)江師范學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100）

氯胺酮（Ketamine）俗稱K粉，是苯環(huán)己哌啶的衍生物，為唯一具有鎮(zhèn)痛作用的靜脈全麻藥，臨床上主要用于全麻的誘導(dǎo)和維持、小兒麻醉及鎮(zhèn)痛［1-2］。氯胺酮可導(dǎo)致幻覺(jué)、妄想、身心分離等精神分裂癥樣表現(xiàn)，造成認(rèn)知功能損傷，長(zhǎng)期濫用可產(chǎn)生與精神分裂癥相似的精神障礙［3-4］。有研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)臺(tái)灣、香港及深圳等地，氯胺酮廣泛存在于污水中，且濃度較高［5-8］。Khan等［6］在北京的污水處理廠中也發(fā)現(xiàn)了氯胺酮的存在，但濃度較低。氯胺酮在地表水中也曾被檢出，濃度一般為幾納克到幾百納克每升［9-10］，可對(duì)人體健康造成威脅。

目前，常見(jiàn)的氯胺酮的提取方法有液-液萃取［11］、固相萃取［12］、液相微萃?。?3］、固相微萃?。?4］等傳統(tǒng)方法，以及磁性固相萃?。?5］等新興技術(shù)。磁性固相萃取的原理是將磁性吸附劑分散于樣品提取液中與目標(biāo)物成分接觸，通過(guò)分子擴(kuò)散使目標(biāo)物快速?gòu)奶崛∫恨D(zhuǎn)移至吸附劑中，然后用強(qiáng)磁鐵吸附磁性吸附劑，棄去提取液后再將目標(biāo)物從吸附劑上洗脫下來(lái)［16］。該方法原材料方便易得、磁性強(qiáng)、可重復(fù)利用，萃取操作簡(jiǎn)單，避免了過(guò)濾、離心等繁瑣操作［17］。Fe3O4磁性納米粒子是目前應(yīng)用最為廣泛的磁性納米材料，然而單一的Fe3O4磁性納米粒子在水中的穩(wěn)定性較差，容易團(tuán)聚，導(dǎo)致其表面積減小，吸附性能降低。生物炭是一種新型的環(huán)保富碳材料，其成本低、環(huán)保且具有可再生和再利用的可能性［18-19］，同時(shí)因具有比表面積大、孔隙率發(fā)達(dá)、表面官能團(tuán)豐富等特點(diǎn)，常被用于吸附水體中的重金屬雜質(zhì)，但其在水溶液介質(zhì)中難以分離，需要進(jìn)行改性。對(duì)生物炭進(jìn)行賦磁改性可以增加其吸附量，便于回收利用［20］。柚子皮內(nèi)表面含有大量的孔隙和纖維素，是優(yōu)質(zhì)生物炭的重要生物質(zhì)來(lái)源，同時(shí)水果廢棄物價(jià)廉易得，為后續(xù)柚子皮等水果廢棄物的減量化、無(wú)害化和資源化利用提供了基礎(chǔ)條件［21-22］。

本文以柚子皮為生物質(zhì)原料，嫁接Fe3O4磁性納米粒子制備磁性生物炭（MBC）復(fù)合材料，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）建立了一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)水中氯胺酮的方法。方法具有分析時(shí)間短、分離能力強(qiáng)、定性分析結(jié)果可靠、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，該法成本較低、原料簡(jiǎn)單易得、綠色環(huán)保，利于推廣使用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API4000Qtrap超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)ABSciex公司），ZeissGenimi500場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（德國(guó)Zeiss公司），NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），RenishawinVia拉曼光譜儀（英國(guó)Renishaw公司），LakeShore7404振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（美國(guó)LakeShore公司），ME-204分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品（C13H16ClNO，純度＞99．0%）由CFW Laboratories，Inc．（美國(guó)紐瓦克）提供；甲醇、甲酸（色譜純，霍尼韋爾（中國(guó)）有限公司）；乙酸銨（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。實(shí)驗(yàn)所用其它化學(xué)品均為分析級(jí)，無(wú)需進(jìn)一步純化。柚子購(gòu)自中國(guó)重慶。

1.2 磁性生物炭的制備

柚子皮切成小塊，用超純水洗滌除去雜質(zhì)，于80℃下干燥48 h。將干燥的柚子皮塊研磨成細(xì)粉后浸入8 mol/L KOH溶液（質(zhì)量比1∶1）中30 min。將1．8 g FeCl2·4H2O和4．0 g FeCl3·6H2O放入裝有機(jī)械攪拌器的三口燒瓶中，在通氮?dú)鈼l件下，加入60 mL超純水，加熱至60℃并保持30 min。然后，向混合反應(yīng)體系中加入20 mL 28%NH3·H2O，攪拌40 min，制備得到Fe3O4。將所得產(chǎn)物通過(guò)外部磁場(chǎng)從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用乙醇和超純水反復(fù)洗滌，直至濾液達(dá)到恒定的pH值。最后，將磁性產(chǎn)物在60℃真空烘箱中干燥。

將Fe3O4和10．0 g KOH活化柚子皮粉末浸入100 mL純水中，室溫下攪拌12 h，沉淀物經(jīng)外部磁鐵分離并在60℃真空下干燥。隨后將混合物放入管式爐慢速熱解（氮?dú)獗Ｗo(hù)下的加熱速率為5℃/min），并于600℃下連續(xù)熱解2 h，使其熱解完全。冷卻至室溫后，將熱解產(chǎn)物浸入1 mol/L HCl中去除堿等雜質(zhì)，用乙醇和超純水反復(fù)洗滌，直至濾液pH值為中性，干燥，研磨并儲(chǔ)存于干燥器中。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色 譜 柱：美 國(guó)Waters ACQUITY UHPLC?BEH C18（100 mm×2．1 mm內(nèi) 徑，1．7 μm），柱溫：40℃。流動(dòng)相A為2 mmol/L乙酸銨水溶液（含0．1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序：0~1 min，10%B；1~3．5 min，10%~90%B；3．5~5 min，90%B；5~5．5 min，90%~10%B。進(jìn)樣量為5 μL，流速為0．3 mL·min-1。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）用于質(zhì)譜檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）用于監(jiān)測(cè)分析物。碰撞室入口電壓為10．0 V，離子源溫度為550℃，氣幕氣壓、霧化氣壓和輔助氣壓分別為0．21、0．34、0．34 MPa。氯胺酮的最佳質(zhì)譜參數(shù)為：保留時(shí)間1．26 min，母離子為m/z237．8，定量和定性子離子分別為m/z124．8和219．8，去簇電壓（DP）分別為25、20 V，碰撞能（CE）分別為24、14 V。在最佳條件下，可獲得尖銳，較為對(duì)稱的色譜峰形。

1.4 樣品處理

將水樣過(guò)濾后量取100 mL，加入適量吸附劑充分振蕩，然后利用外磁場(chǎng)將吸附劑與水樣分離，最后以解吸溶劑洗脫吸附劑上的氯胺酮。解吸溶液經(jīng)0．22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性生物炭的表征分析

2.1.1 掃描電鏡分析由圖1A可知Fe3O4納米粒子呈近似球形。磁性生物炭的掃描電鏡圖（圖1B）顯示，磁性生物炭表面缺陷較多，具有粗糙的三維立體結(jié)構(gòu)，有利于增大生物炭的總比表面積。在50 000倍放大倍數(shù)下可以清晰觀察到Fe3O4納米粒子成功附著在生物炭表面（圖1C），證明磁性生物炭成功合成。

圖1 Fe3O4（A）和MBC（B~C）的掃描電鏡圖Fig．1 SEM images of Fe3O4（A）and MBC（B-C）B．1 200×，C．50 000×

2.1.2 振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)表征MBC在常溫條件下的磁滯回線呈光滑的S形（圖2），磁場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到一定值后，呈飽和磁化狀態(tài)，磁化強(qiáng)度不隨磁場(chǎng)強(qiáng)度的增大而變化，磁性生物炭的飽和磁化強(qiáng)度值為24．22 emu/g。當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度減小到0時(shí)，磁化強(qiáng)度并不為0；繼續(xù)增加反向磁場(chǎng)，鐵磁材料達(dá)到反向飽和磁化狀態(tài)，說(shuō)明其具有良好的磁響應(yīng)性，在外部磁場(chǎng)下，可與樣品溶液有效分離。

圖2 磁性生物炭的磁滯回線Fig．2 Hysteresis loop of magnetic biochar

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)磁性生物炭對(duì)樣品的高效吸附，對(duì)吸附劑用量、吸附時(shí)間、溶液pH值進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 吸附劑用量吸附劑用量是吸附過(guò)程中需要考慮的主要因素。通過(guò)測(cè)定萃取回收率對(duì)不同用量（1~9 mg）的磁性生物炭材料進(jìn)行考察。由于MBC提供了豐富的活性吸附位點(diǎn)，萃取回收率隨著磁性生物炭量的增加而增加。當(dāng)吸附劑用量為7 mg時(shí)，活性位點(diǎn)飽和，氯胺酮的萃取回收率最高；進(jìn)一步增加MBC用量，氯胺酮的回收率反而下降。故選擇7 mg為最佳吸附劑用量。

2.2.2 吸附時(shí)間要達(dá)到良好的萃取效果需要充分的吸附時(shí)間，考察了振蕩時(shí)間為10~60 min時(shí)磁性生物炭的吸附效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，初始階段回收率隨時(shí)間延長(zhǎng)緩慢增加，隨著越來(lái)越多的吸附位點(diǎn)被占據(jù)，在50 min時(shí)吸附劑與被分析物之間達(dá)到吸附平衡，萃取效率不再隨時(shí)間的增加而變化。因此，選擇50 min為最佳吸附時(shí)間。

2.2.3 溶液pH值由于溶液的pH值對(duì)分析物的存在形式（解離或非解離）和吸附劑表面的電荷密度有較大影響，因此溶液的pH值在吸附過(guò)程中對(duì)萃取效率起著關(guān)鍵作用。氯胺酮pKa值為7．5，磁性生物炭的零點(diǎn)電荷為8．9。通過(guò)氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值考察了pH 2．0~12．0條件下氯胺酮的回收率（圖3），結(jié)果顯示，pH 9．0時(shí)吸附性能最佳，此時(shí)磁性生物炭表面帶正電，氯胺酮呈解離狀態(tài)，表面帶負(fù)電，兩者間以靜電吸附為主要作用力，吸附量大，回收率高。

圖3 溶液pH值對(duì)氯胺酮回收率的影響Fig．3 Effect of solution pH value on ketamine recovery

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)MBC對(duì)氯胺酮具有很好的吸附性，吸附后的樣品中未檢出氯胺酮。解吸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇-甲酸（95∶5，體積比）對(duì)氯胺酮有較高的回收率。因此，基于甲醇-甲酸混合溶液的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)解吸條件進(jìn)一步優(yōu)化，以解吸溶劑甲酸占甲醇的比例（A，%）、解吸體積（B，mL）、解吸時(shí)間（C，min）為連續(xù)變化的自變量，以氯胺酮的回收率為考察指標(biāo)（響應(yīng)值），在置信度為95%（α=0．05）條件下，設(shè)置三因素三水平的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。吸附條件：氯胺酮 為10 μg·L-1，在25℃恒 溫振蕩器中以155 r·min-1進(jìn)行振蕩。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3個(gè)平行，對(duì)照實(shí)驗(yàn)在不添加吸附劑的條件下同時(shí)進(jìn)行。表1詳細(xì)列出了設(shè)計(jì)矩陣和階乘水平，根據(jù)表1設(shè)置三因素三水平17次隨機(jī)實(shí)驗(yàn)（表2）。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表Table 1 Response surface optimization experiment

2.3.1 方差分析根據(jù)表2結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立回歸模型，得到殘差分析線性方程為Y=95．49-1．32A+1．78B+1．90C-0．39AB+6．62AC+2．57BC-3．81A2-5．01B2-10．31C2。方程中的正號(hào)表示參數(shù)之間的協(xié)同作用，負(fù)號(hào)表示拮抗作用。

表2 三因子Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（n=3）Table 2 Box-Behnken experiment design with three independent variables（n=3）

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別進(jìn)行方差分析（ANOVA），通過(guò)F檢驗(yàn)和P值評(píng)估模型的顯著性和適用性。方差分析結(jié)果如表3所示，該模型F值（15．31）大于臨界值F0．05（2，14）=3．739，P值小于0．01，表明差異極顯著，模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)變異量，建模成功。失擬項(xiàng)P值為0．675 6，差異不顯著，表明本研究所得方程與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合中的非正常誤差所占比例較小，可以用該回歸方程取代實(shí)驗(yàn)中的真實(shí)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

（續(xù)表3）

2.3.2 各因素交互作用分析根據(jù)回歸分析結(jié)果繪制解吸溶劑甲酸比例、解吸體積、解吸時(shí)間三因素對(duì)氯胺酮回收率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖（圖4）。

圖4 交互作用對(duì)氯胺酮回收率的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig．4 The response surface plots and contour maps of the interaction on the recovery of ketamine

由圖可看出，甲酸比例與解吸體積、甲酸比例與解吸時(shí)間、解吸體積與解吸時(shí)間的響應(yīng)面圖均呈凸形曲面。圖4A曲面較緩，表明甲酸比例與解吸體積的交互作用相對(duì)不明顯；圖4B、4C響應(yīng)面圖曲面較陡且等高線圖呈橢圓形，表明甲酸比例和解吸時(shí)間交互作用相對(duì)明顯，而解吸體積和解吸時(shí)間交互作用最明顯，與方差分析表一致。通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化和求解，得到水中氯胺酮的最佳檢測(cè)條件為：解吸劑（V甲酸∶V甲醇=5∶95）、解吸劑體積5．6 mL、解吸時(shí)間53 min。

2.4 檢出限與定量下限

在最優(yōu)條件下對(duì)所建立的方法進(jìn)行評(píng)估，并分別以信噪比（S/N）約為3和10計(jì)算檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。在1~100 μg·L-1線性范圍內(nèi)，氯胺酮的峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）呈良好的線性關(guān)系Y=35．3X，相關(guān)系數(shù)（r）為0．999 7，LOD和LOQ分別為0．263 μg·L-1和0．878 μg·L-1。

2.5 實(shí)際樣品分析

采用所建立的方法測(cè)定3種不同水樣（自來(lái)水、礦泉水、純凈水）中氯胺酮的含量，結(jié)果均未檢出。自來(lái)水樣品中氯胺酮的加標(biāo)（10 μg·L-1）色譜圖如圖5所示。向3種陰性水樣中分別添加1、10、20、50 μg·L-14個(gè)水平的氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下考察方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），樣品回收率結(jié)果見(jiàn)表4。氯胺酮在3種樣品中的回收率為84．0%~99．9%，其日內(nèi)和日間RSD分別為0．40%~3．4%和0．25%~1．9%。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，可用于水中氯胺酮含量的檢測(cè)。

圖5 自來(lái)水樣品加標(biāo)（10 μg·L-1）色譜圖Fig．5 Chromatogram of a spiked（10 μg·L-1）tap water sample

表4 樣品加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The recoveries and relative standard deviations of actual samples

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以磁性生物炭為吸附劑萃取水中的氯胺酮，并結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)化的條件為：磁性生物炭材料用量為7 mg、吸附時(shí)間50 min、溶液pH值9．0、解吸劑（V甲酸∶V甲醇=5∶95）、解吸劑體積5．6 mL、解吸時(shí)間53 min。結(jié)果表明，所建立的方法具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，滿足實(shí)際檢測(cè)要求，適用于水中氯胺酮的檢測(cè)，為我國(guó)質(zhì)檢部門(mén)在食品監(jiān)管、打擊飲用水中非法添加物和禁毒方面的工作提供了技術(shù)參考。