張 敏，黃京平，趙 文，王 鵬，金 玥，胡 菡，張金振

（中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京 100193）

蜂蜜中含有維生素、氨基酸、酚酸、黃酮等豐富的生物活性物質，不僅具有較高的營養(yǎng)價值，還具有抗菌、抗氧化和調(diào)節(jié)機體免疫力等功效［1-3］。酚酸和黃酮類物質是蜂蜜中重要的生物活性成分，如對羥基苯甲酸、咖啡酸苯乙酯、木犀草素、槲皮素、山奈酚、芹菜素和柯因等已被證實具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等功效［4-7］。蜂蜜中已發(fā)現(xiàn)的酚酸和黃酮類物質達幾十種，且在不同植物源蜂蜜中的含量差異較大，可作為鑒別蜂蜜植物源的生物標記物［8］。

蜂蜜基質復雜，測定酚酸和黃酮類物質時，需先對樣品中的目標化合物進行提取、凈化和富集。文獻報道的前處理方法主要有液-液萃?。?-14］、固相萃?。⊿PE）［15-25］等。其中液-液萃取程序復雜、耗時長，需要大量的有機溶劑，污染環(huán)境，而固相萃取法具有操作簡單、萃取試劑用量少、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，已廣泛應用于前處理領域。高效液相色譜法［18-23］是測定蜂蜜中酚酸和黃酮類物質的常用方法。但該方法分析時間長，靈敏度低，且不同化合物具有不同的最佳吸收波長，共流出物易對結果產(chǎn)生干擾，多組分分離難度大，影響結果準確度。超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法具有分析時間短、靈敏度高等優(yōu)點，是近年來應用較為廣泛的酚酸和黃酮類物質的分析方法［12-13，22-24］。

本研究采用固相萃取結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定蜂蜜中的24種酚酸和黃酮類化合物。該方法簡單、快捷，可同時完成定性和定量分析，為蜂蜜中酚酸和黃酮類化合物的含量測定及不同植物源蜂蜜的鑒別提供了技術支撐。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純）購于德國Merck公司；甲酸（色譜純）購于美國Fisher Scientific公司；氨水購于北京化工廠。固相萃取柱：SHIMSEN Styra MAX（150 mg/6 mL）購于島津公司，Bond Elut Plexa PAX（200 mg/6 mL）購于Agilent公司，Oasis HLB（200 mg/6 mL）購于Waters公司；24種酚酸和黃酮類化合物的純度均≥98%，購于上海源葉公司。洋槐蜜（Acacia honey）、棗花蜜（Jujube honey）、椴樹蜜（Linden honey）、蕎麥蜜（Buckwheat honey）、荊條蜜（Vitex honey），每個植物源蜂蜜3個樣品共15批次購于蜂場（信息見表1），于4℃保存。

表1 樣品信息Table 1 Informations of honey samples

1.2 儀器與設備

Agilent 6495高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI源）（美國Agilent公司）；千分之一天平、十萬分之一天平（上海梅特勒-托利多公司）；TTL-DCⅡ水浴氮吹儀（同泰聯(lián)公司）；Vortex-Genie2渦旋混合器（美國Scientific Industries）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（Integral5，美國Milli-Q公司）；SPE裝置（美國Agilent公司）。

1.3 標準溶液的配制

1.3.1 標準儲備液用甲醇將各化合物溶解并稀釋成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，轉移至棕色瓶中于-18℃保存，備用。

1.3.2 標準工作液溶劑標準工作液：用0．1%甲酸-80%甲醇水溶液將標準儲備液稀釋成質量濃度分別為2、5、10、50、100、200、500、1 000 μg/L的混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質標準工作液：采用“1．4”方法處理果葡糖漿制備空白基質溶液，將標準儲備液稀釋成質量濃度分別為2、5、10、50、100、200、500、1 000 μg/L的混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取稱取樣品2 g（精確至0．01 g）于50 mL離心管中，加入5 mL去離子水渦旋充分溶解，用氨水調(diào)至pH 6．0，待凈化。

1.4.2 樣品凈化將樣液全部轉移至依次用5 mL甲醇和5 mL去離子水活化的SHIMSEN Styra MAX固相萃取柱，待樣液全部流出后，用5 mL超純水淋洗，抽干小柱，然后用5 mL 5%甲酸-甲醇乙腈（甲醇∶乙腈=1∶1）溶液洗脫，收集洗脫液于40℃氮吹至近干，用1 mL 0．1%甲酸-80%甲醇水溶液復溶，過0．22 μm尼龍濾膜，待測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2．1 mm×100 mm，1．8 μm）；柱溫：35℃；流動相A相：0．1%甲酸水溶液，B相：乙腈；梯度洗脫程序：0~1 min，95%A；1~8．5 min，95%~30%A；8．5~8．6 min，30%~0%A；8．6~11 min，0%~95%A；11~14 min，95%A；流速：0．35 mL/min；進樣體積：2 μL。

1.5.2 質譜條件電噴霧離子源負離子模式（ESI-）；多反應監(jiān)測模式（MRM）；鞘氣溫度：290℃；鞘氣流速：11 L/min；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：9 L/min；霧化氣壓力：310 kPa；碎裂電壓：380 V；毛細管電壓：3 500 V；保留時間、母離子、子離子等其他質譜參數(shù)見表2。

表2 24種目標化合物的MRM參數(shù)Table 2 MRM parameters for 24 target compounds

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

將質量濃度為100 μg/L的各標準工作溶液，分別采用正、負離子掃描模式進行全掃描。由于待測目標化合物均帶有羥基，易失去氫質子形成負離子峰，因此在負離子模式下具有更高的響應。以待測化合物的分子離子峰為母離子，采用子離子掃描模式選擇最優(yōu)的2個離子并確定定性離子和定量離子，在MRM模式下優(yōu)化獲得最佳質譜條件（見表2）。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

化合物的峰形、分離度和響應強度受流動相和色譜柱的影響。實驗比較了ACQUITY UPLC BEH C18（2．1 mm×50 mm，1．7 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3（2．1 mm×100 mm，1．8 μm）2種色譜柱以及甲醇-0．1%甲酸水溶液和乙腈-0．1%甲酸水溶液2種流動相的不同組合，對目標化合物峰形、分離效果及響應強度的影響。因大部分待測物含有酚羥基和羧基，分子極性較強，采用HSS T3色譜柱和乙腈-0．1%甲酸水溶液流動相時，24種目標化合物具有更強的保留能力和對稱的峰形，尤其是增強了沒食子酸的保留能力，改善了山奈酚和異鼠李素的峰拖尾現(xiàn)象。優(yōu)化得到最佳色譜條件如“1．5．1”所示，該條件下24種化合物的特征離子譜圖見圖1。

圖1 24種目標化合物的特征離子譜圖Fig．1 MRM chromatograms of 24 target compounds the peak numbers denoted were the same as those in Table 2

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇目標化合物多含有酚羥基，呈弱酸性，MAX和PAX均屬于混合型陰離子反相吸附固相萃取柱，具有陰離子交換和反向保留的作用，適于酸性化合物的萃取。HLB固相萃取柱耐受的pH值范圍較廣，對非極性至中性的化合物均有較好回收，是目前蜂蜜中酚酸和黃酮類化合物測定常用的固相萃取柱。比較了MAX、PAX和HLB 3種固相萃取柱的凈化效果（見圖2）。結果顯示，采用HLB柱凈化時，原兒茶酸、沒食子酸、鞣花酸、蘆丁、槲皮素的回收率低于60%；PAX柱凈化時，沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、異鼠李素的回收率低于60%；MAX柱凈化時的整體回收率較好（均＞60%）。因此，本研究選擇MAX固相萃取柱對樣品進行凈化。

圖2 不同類型固相萃取柱對目標化合物回收率的影響Fig．2 Effects of different SPE columns on the recoveries of 24 target compounds

2.3.2 樣品溶液pH值的選擇樣品pH值是影響提取效果的重要因素，當pH＜pKa時，化合物以分子狀態(tài)存在。以水為提取溶液，結合目標化合物的pKa值，比較了樣品溶液pH值分別為4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0時，MAX固相萃取柱對目標化合物回收率的影響（圖3）。結果表明，隨著pH值的增加，目標化合物的整體回收率先增大后降低，當pH為6．0時，目標化合物的整體回收率較高，為62．7%~109%。因此，選擇最佳提取條件為pH 6．0。

圖3 樣品溶液pH值對目標化合物回收率的影響Fig．3 Effects of pH value on the recoveries of 24 target compounds

2.3.3 洗脫溶劑的選擇為中和目標化合物的電荷，達到最佳洗脫效果，結合文獻［16-17］，選取甲醇、2%甲酸甲醇、5%甲酸甲醇、6%甲酸甲醇作為洗脫溶劑，通過洋槐蜂蜜加標回收的方式考察洗脫效果。結果顯示，目標化合物的回收率隨著甲酸含量的增加而提高，當甲酸為5%時，目標化合物的洗脫效果較好。繼續(xù)增加甲酸含量，沒食子酸、綠原酸的回收率降低。比較了5%甲酸甲醇和5%甲酸-甲醇乙腈（甲醇∶乙腈=1∶1）的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)當加入乙腈后，桑色素、柚皮苷的回收率提高，其他目標化合物的回收率基本不變，最終確定洗脫溶劑為5%甲酸-甲醇乙腈（甲醇∶乙腈=1∶1）。

洗脫溶劑的用量也會影響目標化合物的洗脫效果，用量少時目標化合物洗脫不完全，用量大則造成試劑的浪費。以洋槐蜂蜜加標回收的方式，比較了不同洗脫溶劑用量（2、3、4、5、6 mL）時目標化合物的洗脫效果。結果表明，洗脫溶劑用量為2 mL時，目標化合物洗脫不完全，桑色素的回收率僅為12．5%。隨著洗脫溶劑用量的增加，目標化合物的回收率逐漸增大，當洗脫溶劑用量為5 mL時，目標化合物具有較好的洗脫效果，回收率為60．5%~106%；繼續(xù)增大洗脫溶劑用量，目標化合物的回收率基本不變。因此，選擇洗脫溶劑用量為5 mL。

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質效應酚酸和黃酮類化合物在蜂蜜中屬于內(nèi)源性化合物，因此以果葡糖漿代替蜂蜜，配制系列基質標準溶液，根據(jù)下式計算基質效應（ME）：ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率×100%。若ME為80%~120%，表明存在弱基質效應，可忽略影響；ME＜80%，為基質抑制效應，ME＞120%，則為基質增強效應，均需采取措施減少基質影響［26］。由表3可知，綠原酸（ME=70．6%）、鞣花酸（ME=56．3%）、迷迭香酸（ME=77．3%）、水楊酸（ME=72．3%）、槲皮素（ME=74．5%）、柚皮苷（ME=75．8%）和短葉松素（ME=65．9%）具有基質抑制效應，因此采用基質標準曲線法進行定量。

表3 24種化合物的線性方程、相關系數(shù)、基質效應和定量下限Table 3 Linear equations，correlation coefficients，matrix effects，limits of quantitation of 24 target compounds

2.4.2 線性與定量下限將基質標準工作溶液按“1．5”條件測定，以化合物的質量濃度為橫坐標（x，μg/L），對應的峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。結果顯示，各化合物在2~1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)（r2）均大于0．998（見表3）。以10倍信噪比（S/N=10）對應的質量濃度為定量下限（LOQ）［27］，24種化合物的定量下限為2~10 μg/kg（見表3）。

2.4.3 回收率與相對標準偏差采用洋槐蜂蜜進行200、400、1 000 μg/kg 3個水平的加標回收實驗，每個濃度水平重復6次，連續(xù)測定3 d。由表4可知，蜂蜜中24種化合物的回收率為60．3%~111%，日內(nèi)相對標準偏差（RSD）為0．80%~8．5%，日間RSD為1．1%~7．4%。表明本方法的準確性和重復性滿足分析要求，可用于實際樣品測定。

表4 24種目標化合物的回收率和相對標準偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of 24 target compounds

2.5 實際樣品的測定

采用本方法對洋槐、棗花、荊條、椴樹和蕎麥5種植物源蜂蜜共15批次樣品進行測定，結果見圖4，含量值見表5。結果顯示，所有蜂蜜樣品中均含有沒食子酸、原兒茶酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、短葉松素、松屬素、槲皮素、異鼠李素、高良姜素、莰菲醇和柯因等18種化合物，均不含有迷迭香酸和桑色素。

表5 不同種類蜂蜜中酚酸和黃酮類化合物的含量Table 5 Contents of phenolic acids and flavonoids in different types of honey samples

圖4 不同種類蜂蜜中酚酸和黃酮類化合物的組成Fig．4 Composition of phenolic acids and flavonoids in different types of honey

除洋槐蜜外，其余4種植物源蜂蜜以酚酸類化合物為主，蕎麥蜜中對羥基苯甲酸和對香豆酸的含量高于其他蜂蜜，平均含量分別為16 823．53 μg/kg和4 118．85 μg/kg。荊條蜜中綠原酸的含量高于其他蜂蜜，平均含量為2 002．48 μg/kg。洋槐蜜中異鼠李素、短葉松素、柯因和松屬素等黃酮類化合物的含量相對較高，與Truchado等［28］測定意大利和斯洛伐克洋槐蜜的結果基本一致。椴樹蜜中原兒茶酸的含量相對較高，平均含量為1 186．13 μg/kg，黃酮類化合物如蘆丁、莰菲醇、木犀草素的含量較低。Sergiel等［8］鑒定得到波蘭椴樹蜜的原兒茶酸平均含量為1 390 μg/kg，蘆丁、莰菲醇、木犀草素的含量均低于30 μg/kg，本研究與其結果較一致。棗花蜜中對羥基苯甲酸、咖啡酸、莰菲醇的含量相對較高，楊二林等［29］研究表明，陜西不同地區(qū)棗花蜂蜜均含有原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸、莰菲醇和松屬素，但含量與本研究結果存在一定差異，說明蜂蜜中酚酸和黃酮的含量受地區(qū)、地理條件的影響［30-31］。

對所有樣品檢出的22種化合物進行Pearson相關性分析，結果見圖5。酚酸類化合物對羥基苯甲酸和對香豆酸具有良好的相關性，相關系數(shù)為0．96；黃酮類化合物高良姜素與短葉松素、松屬素、柯因之間也具有良好的相關性，相關系數(shù)均大于0．85。

圖5 蜂蜜中酚酸和黃酮類化合物的相關性Fig．5 Correlations of phenolic acids and flavonoids in honey samples

3 結論

本文建立了固相萃取結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定蜂蜜中24種酚酸和黃酮類化合物的方法。該方法前處理簡單、分析時間短、靈敏度高、結果準確。采用該方法測定蕎麥、棗花、洋槐、荊條和椴樹5種植物源蜂蜜，結果顯示，不同植物源蜂蜜樣品在酚酸和黃酮類組成上具有相似性，均含有沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、莰菲醇、異鼠李素、松屬素等18種化合物，但在含量上具有差異性。該研究為蜂蜜中酚酸和黃酮類化合物的測定和蜂蜜植物源的鑒別提供了技術支撐。