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        基于雜交指示劑的無標(biāo)記適配體電化學(xué)傳感器用于鉛離子檢測

        2022-11-18 10:07:22張雨婷陳灝翰王曉麗周楠迪
        分析測試學(xué)報 2022年11期
        關(guān)鍵詞:信號檢測

        張雨婷,陳灝翰,李 惠,王曉麗,周楠迪

        (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

        鉛離子(Pb2+)作為毒性最強(qiáng)的重金屬污染物之一,其污染環(huán)境后難以自然降解或無害化,進(jìn)入有機(jī)體后有較強(qiáng)的生物蓄積毒性,會對環(huán)境安全和人類健康造成巨大威脅[1-2]。因此,開發(fā)一種簡單、可靠的Pb2+檢測方法對于環(huán)境和人類健康均有著至關(guān)重要的作用。目前Pb2+的傳統(tǒng)檢測方法主要有原子吸收光譜法[3]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[4]、表面等離子共振法[5]等。這些方法雖準(zhǔn)確可靠,但存在著操作繁瑣、儀器昂貴、基質(zhì)干擾嚴(yán)重、需要專業(yè)人員操作等缺點,限制了其實際應(yīng)用尤其是在線快速分析領(lǐng)域的應(yīng)用[6-7]。為克服上述困難,研究者們運用熒光法[8]、比色法[9]、電化學(xué)發(fā)光法[10]、電化學(xué)分析法[11]等方法實現(xiàn)了對Pb2+的檢測。隨著近年來微電子技術(shù)的發(fā)展和新材料的應(yīng)用,電化學(xué)傳感器以其高靈敏度、便攜性及低成本等優(yōu)點受到了廣泛關(guān)注。

        電化學(xué)傳感器是以酶、抗體、適配體、細(xì)胞等為特異性識別元件,通過對待測目標(biāo)捕獲后電極表面電子傳遞能力變化的檢測,從而將待測物質(zhì)的濃度信號轉(zhuǎn)換成電信號進(jìn)行定量分析[12-13]。對比其他識別原件,適配體作為一類能夠特異性識別小分子、蛋白分子甚至細(xì)胞的寡核苷酸片段,因其高穩(wěn)定性、低成本和多功能性而越來越多的應(yīng)用于檢測分析領(lǐng)域[14-15]。Abu-Ali等[16]利用末端修飾電化學(xué)信號分子的適配體作為識別原件,當(dāng)與Pb2+結(jié)合后,DNA構(gòu)象改變并引起信號分子與電極表面距離的變化,從而引起電化學(xué)信號改變,實現(xiàn)Pb2+的定量檢測。董杰等[17]利用PtNPs@Cu-MOF信號探針和DNA walker信號放大技術(shù)開發(fā)了一種靈敏檢測Pb2+的電化學(xué)傳感器。然而無論是電化學(xué)活性分子還是納米探針作為信號標(biāo)記的適配體傳感器,均需在適配體末端修飾信號分子,使得傳感器構(gòu)建需花費大量成本和精力。

        適配體由于本身結(jié)構(gòu)的特殊性,在信號檢測方面展示出其他生物識別原件無可比擬的優(yōu)異性能,不僅可以通過末端修飾信號基團(tuán)引入可檢測信號,還可通過指示劑吸附插入等方式構(gòu)建無需提前信號標(biāo)記的檢測方法,大大降低了傳感器的制備成本和操作難度[18-19]。亞甲基藍(lán)(MB)作為一種有機(jī)染料分子,可定向插入DNA互補(bǔ)配對形成的雙鍵之中,且其具備良好的電化學(xué)活性,因此經(jīng)常作為一種電信號探針應(yīng)用于電化學(xué)適配體傳感器中[20-21]。

        本研究通過將Pb2+適配體修飾于電極表面,并與其cDNA通過堿基互補(bǔ)配對形成雙鏈的形式吸附雜交指示劑MB作為電化學(xué)信號物質(zhì),利用適配體對重金屬Pb2+的特異性識別后雙鏈的定量打開,釋放出MB,構(gòu)建了一種基于MB信號“Turn off”的無標(biāo)記適配體電化學(xué)傳感器,為環(huán)境或食品工業(yè)中Pb2+的快速在線分析提供了一種便捷、靈敏的新型分析方法。

        1 實驗部分

        1.1 儀器與試劑

        CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司);三電極系統(tǒng):工作電極為金電極(AuE,Φ=3 mm)或修飾電極,參比電極為銀/氯化銀(飽和氯化鉀)電極,對電極為鉑絲電極;電子分析天平(賽多利斯BSA224S);泰坦UC-6超聲波清洗機(jī)(上海泰坦科技股份有限公司);HH-B11-BS-I恒溫培養(yǎng)箱(上海泰坦科技股份有限公司);Ultra-low organic型超純水機(jī)(上海淶科儀器有限公司);KX-79-1型磁力攪拌器(江蘇科析儀器有限公司);MX-S漩渦振蕩器(美國賽洛捷克公司),CF15RN離心機(jī)(日本日立公司)。

        乙酸鉛標(biāo)準(zhǔn)品、氯化鈉、氯化鎂、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸、氯化鉀、氯化鈣、亞甲基藍(lán)、磷酸氫二鉀、硫酸、磷酸二氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris,上海生工生物工程股份有限公司);6-巰基己醇(美國Sigma-Aldrich公司);0.05 μm氧化鋁粉末(浙江理協(xié)儀器公司)。所有試劑若無特殊說明均為分析純,實驗用水為去離子水(18 MΩ·cm)。

        所用DNA核酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;Pb2+適配體:GGGTGGGTGGGTGGGT,cDNA序列:CACCCTCCCAC。

        1.2 金電極預(yù)處理

        在食人魚溶液(H2SO4∶H2O2=7∶3)中浸泡15 min,分別在水和無水乙醇中超聲3 min,再在0.3 μm和0.05 μm氧化鋁懸浮液中分別打磨3 min。用水沖凈后在0.5 mol/L硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(-0.2~1.5 V,掃描速率1 V/s,循環(huán)次數(shù)100次),再用水沖凈,氮氣吹干后備用。

        1.3 適配體與金電極孵育

        用Tris-HCl緩沖溶液(10 mmol/L Tris,1 mol/L NaCl,1 mmol/L MgCl2,pH 7.4)將Pb2+適配體序列(GGGTGGGTGGGTGGGT)及cDNA序列(CACCCTCCCAC)稀釋至目標(biāo)濃度。取5 μL 0.1 μmol/L的鉛離子適配體(Apt)滴加到處理好的金電極表面,室溫下孵育12 h后用Tris-HCl緩沖溶液清洗電極以備后續(xù)使用。將修飾有Apt的金電極浸泡在2 mmol/L 6-巰基己醇(MCH)中,37℃下孵育1 h后用Tris-HCl清洗電極以備后續(xù)使用。

        1.4 互補(bǔ)雙鏈的形成及雜交指示劑的吸附插入

        取5 μL 1 μmol/L的cDNA滴加至處理好的金電極表面,37℃下孵育2 h與Apt形成雙鏈,再用Tris-HCl清洗電極以備后續(xù)使用。將上述修飾電極浸泡在1.6 mmol/L亞甲基藍(lán)(MB)溶液中,37℃下孵育1 h,MB即吸附到DNA雙鏈中產(chǎn)生電信號。用Tris-HCl清洗電極以備后續(xù)使用。

        1.5 傳感器檢測Pb2+的電化學(xué)測試

        將上述修飾電極浸泡在含不同濃度Pb2+的Tris-HCl緩沖溶液中,37℃下孵育一段時間后,用3 mL Tris-HCl緩沖溶液和3 mL水沖洗,進(jìn)行電化學(xué)測試。電化學(xué)測試采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng),所有測量均在室溫下進(jìn)行。循環(huán)伏安測試(CV)和電化學(xué)阻抗測試(EIS)在含0.1 mol/L KCl的5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行,其中,EIS的頻率范圍為10-2~105Hz,振幅為5 mV。差分脈沖伏安(DPV)測試在Tris-HCl緩沖溶液中進(jìn)行,起始電勢-0.5 V,終止電勢0.1 V,振幅0.05 V,脈沖寬度0.05 s,取樣寬度0.016 666 7 s,脈沖周期0.2 s,靜態(tài)時間2 s,DPV測定掃描時間為30 s。

        1.6 PAGE凝膠電泳分析

        使用電泳儀(美國Bio-Rad)進(jìn)行PAGE凝膠電泳實驗,并通過UV凝膠電泳成像儀(SmartGel 600,北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)記錄成像。將混合有6×TEK載樣緩沖液(pH 8.0,50%甘油,0.25%溴酚藍(lán))的DNA溶液注入12%天然聚丙烯酰胺凝膠中。在1×TBE電泳液(pH 8.0)、120 V恒定電壓電泳分析1 h。凝膠用Gelred核酸凝膠染色液染色后,記錄圖像。

        1.7 實際樣品檢測

        牛奶樣品:先用20%三氯乙酸將牛奶樣品溶液調(diào)至pH 4.6,在45℃下孵育15 min使蛋白質(zhì)變性后,采用10 000 r/min離心15 min去除沉淀的蛋白,再將不同濃度的Pb2+添加到處理好的牛奶樣品的上清液中,得到含有不同靶標(biāo)濃度的牛奶樣品。

        湖水樣品:水樣以8 000 r/min離心15 min,過0.22 μm膜,用10 mmol/L Tris緩沖液調(diào)至pH 7.4,采用本方法進(jìn)行加標(biāo)回收實驗,計算回收率。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 適配體電化學(xué)傳感器的工作原理

        本研究基于適配體與Pb2+高特異性結(jié)合后,使插入堿基對間的雜交指示劑MB定量游離,從而實現(xiàn)響應(yīng)信號的“Turn off”變化,發(fā)展了一種檢測Pb2+的適配體電化學(xué)傳感器。傳感器的工作原理如圖1所示。首先將Pb2+適配體修飾至金電極,再將與適配體互補(bǔ)的cDNA與適配體進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對。形成雙鏈后,將MB嵌入到DNA雙鏈中。此時,當(dāng)不存在Pb2+時,插入雙鏈間的豐富的MB在DPV掃描中產(chǎn)生較大的峰電流;當(dāng)加入Pb2+時,Pb2+與適配體結(jié)合導(dǎo)致DNA雙鏈解開,雙鏈中MB的吸附數(shù)量降低,電信號降低,從而實現(xiàn)對Pb2+的定量、靈敏檢測。

        圖1 基于雜交指示劑的適配體電化學(xué)傳感器檢測Pb2+的原理圖Fig.1 Scheme of aptamer electrochemical sensor based on hybridization indicator for Pb2+detection

        2.2 適配體電化學(xué)傳感器的電化學(xué)表征

        為評估構(gòu)建的適配體電化學(xué)傳感器的電化學(xué)性能,以[Fe(CN)6]3-/4-作為探針,采用交流阻抗法和循環(huán)伏安法(CV)對制備的傳感器進(jìn)行表征[29]。如圖2A所示,裸電極EIS曲線的半圓直徑很小,表明此時的電極表面被處理干凈,氧化還原探針可以自由在電極表面進(jìn)行電子傳遞。修飾適配體后的EIS曲線阻值達(dá)到860 Ω,這是由于核酸適配體磷酸骨架的電負(fù)性與探針[Fe(CN)6]3-/4-之間的靜電排斥所造成。使用MCH封閉后,修飾電極的阻值升高,這是由于電極表面裸露的點位被封閉后,修飾的適配體DNA鏈從電極表面吸附狀態(tài)變?yōu)橐砸欢ń嵌戎绷⒂陔姌O表面,因此對探針的排斥增加。當(dāng)加入cDNA,其與適配體形成雙鏈后負(fù)電荷進(jìn)一步增加,造成EIS曲線的半圓直徑進(jìn)一步增大。最后當(dāng)適配體捕獲Pb2+之后,cDNA從電極表面釋放,導(dǎo)致電極的電子傳遞阻力降低。

        圖2 傳感器構(gòu)建及檢測過程中的EIS表征曲線圖(A)和CV表征曲線圖(B)Fig.2 EIS curves(A)and CV curves(B)during sensor construction and detection

        為一進(jìn)步表征電化學(xué)傳感器的修飾與測定過程,在5 mmol/L K4[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描,結(jié)果如圖2B所示。裸電極的CV曲線在掃描范圍內(nèi)出現(xiàn)一對明顯的且峰形尖銳的氧化還原峰,且峰間距小于100 mV,說明此時電極表面光滑潔凈。修飾適配體后,電極表面由于適配體中磷酸骨架的負(fù)電性對氧化還原探針的排斥作用,使得循環(huán)伏安曲線的峰電流降低。以MCH封閉金電極的剩余點位,并采用cDNA與適配體進(jìn)行雜交孵育之后,進(jìn)一步減少了電子傳遞,循環(huán)伏安曲線的峰電流進(jìn)一步減小,峰間距進(jìn)一步擴(kuò)大。當(dāng)加入Pb2+后,適配體捕獲目標(biāo)離子并釋放出cDNA,造成循環(huán)伏安曲線的峰電流值有所上升。此結(jié)果與上述電化學(xué)阻抗表征結(jié)果一致,進(jìn)一步證明電化學(xué)傳感器構(gòu)建成功。

        2.3 PAGE凝膠電泳分析

        PAGE凝膠電泳被用于直觀驗證傳感方案構(gòu)建的可行性。如圖3所示,泳道1和泳道2分別為Pb2+的適配體(bp為18)和cDNA(bp為11)。當(dāng)Pb2+不存在時,泳道3是由適配體(泳道1)和cDNA(泳道2)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)Pb2+存在時,適配體與Pb2+特異性結(jié)合而造成雙鏈被破壞,因此泳道4顯示變?nèi)醯碾p鏈電泳帶以及被釋放出的cDNA電泳帶。上述結(jié)果表明,所提出的傳感方案是切實可行的。

        圖3 PAGE電泳圖Fig.3 PAGE images

        2.4 差分脈沖法檢測Pb2+

        在Tris-HCl緩沖溶液中進(jìn)行差分脈沖(DPV)掃描,結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出,當(dāng)適配體電化學(xué)傳感器(即修飾有Apt-MCH-cDNA的電極)在無目標(biāo)物的緩沖溶液中進(jìn)行DPV掃描時,由于適配體與cDNA堿基互補(bǔ)配對間插入了大量雜交指示劑MB,在-0.23 V出現(xiàn)了MB的信號峰。當(dāng)傳感器與100 mg/L Pb2+孵育后,Pb2+與Apt的結(jié)合使雙鏈解開,釋放出等比例的MB,從而使MB的峰電流降低。

        圖4 在空白溶液及100 mg/LPb2+溶液孵育后傳感器的DPV響應(yīng)曲線圖Fig.4 DPV curves of the developed sensor incubated in blank Tris-HCl buffer and Tris-HCl buffer containing 100 mg/LPb2+solution

        2.5 實驗條件的優(yōu)化

        本文對影響適配體傳感器對Pb2+檢測的相關(guān)實驗條件進(jìn)行優(yōu)化,包括適配體與cDNA的孵育時間、雜交指示劑MB的使用濃度及吸附時間、目標(biāo)物Pb2+的孵育時間等。

        2.5.1 適配體與cDNA的孵育時間將1 μmol/L cDNA滴加到修飾有Pb2+適配體的金電極表面,孵育不同時間后進(jìn)行后續(xù)實驗,并進(jìn)行DPV測試,結(jié)果如圖5A所示。當(dāng)孵育時間在30~120 min內(nèi),電流值隨孵育時間的增大而增大,當(dāng)孵育時間超過120 min后,電流值穩(wěn)定。因此選取120 min為cDNA的最佳孵育時間。

        2.5.2 雜交指示劑MB的濃度與吸附時間取1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L MB進(jìn)行實驗,結(jié)果如圖5B所示,當(dāng)MB濃度在1.2~1.6 mmol/L之間時,電流值增加較快;當(dāng)MB濃度在1.6~2.0 mmol/L時,電流值增速緩慢。因此取1.6 mmol/L MB進(jìn)行后續(xù)實驗。

        圖5 不同實驗條件對檢測信號的影響Fig.5 Effects of different experimental conditions on detection signal

        進(jìn)一步對MB的孵育時間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖5C所示,隨著孵育時間的延長,電流值逐漸增高,在120 min時達(dá)到最大值。當(dāng)孵育時間超過120 min后,電流值降低。因此,選取120 min為MB的最佳孵育時間。

        2.5.3 Pb2+的孵育時間由于適配體與其目標(biāo)物的特異性結(jié)合需合適的孵育時間,因此,在上述優(yōu)化實驗基礎(chǔ)上,對Pb2+的孵育時間進(jìn)行優(yōu)化。隨著孵育時間的延長,Pb2+與適配體結(jié)合的量增多,MB的DPV掃描峰電流降低(如圖5D所示)。當(dāng)Pb2+孵育時間為60 min時,電流值達(dá)到最低,且隨著時間的增加,電流值趨于穩(wěn)定。因此實驗選取60 min為Pb2+的最佳孵育時間。

        2.6 適配體電化學(xué)傳感器對Pb2+的定量分析

        在最優(yōu)實驗條件下,將0.1、1.0、10.0、100、1 000、10 000、100 000 μg/L Pb2+與適配體電化學(xué)傳感器進(jìn)行孵育,測定不同Pb2+質(zhì)量濃度下傳感器響應(yīng)的DPV曲線,結(jié)果如圖6A所示??梢钥闯鲭S著Pb2+質(zhì)量濃度的增加,由于適配體與目標(biāo)物特異性結(jié)合,使得電活性分子MB的數(shù)量逐漸降低,DPV的峰電流值逐漸減小。以DPV的響應(yīng)峰電流值為縱坐標(biāo),Pb2+質(zhì)量濃度的對數(shù)值(lgρPb2+)為橫坐標(biāo)做圖,可獲得傳感器對Pb2+離子檢測的線性曲線(如圖6B所示)。結(jié)果顯示,在0.1~100 000 μg/L范圍內(nèi),Pb2+的質(zhì)量濃度的對數(shù)(x,μg/L)與DPV電流值(y)之間存在良好的線性關(guān)系,線性方程為y=-0.150x+1.86,相關(guān)系數(shù)(r2)=0.993,檢出限(S/N=3)為33.4 ng/L。

        圖6 不同Pb2+質(zhì)量濃度下適配體電化學(xué)傳感器的DPV曲線以及峰電流值與不同Pb2+質(zhì)量濃度對數(shù)的線性曲線Fig.6 DPV curves obtained at the aptamer electrochemical sensor upon different concentrations of Pb2+(A),calibration curve between peak current and logarithm different concentration of Pb2+(B)

        為評估所構(gòu)建檢測方法對目標(biāo)物檢測的特異性,在最優(yōu)實驗條件下對10 000 μg/L Pb2+、Mn2+、Fe2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+、Ca2+進(jìn)行DPV掃描。結(jié)果如圖7所示,由于其他金屬離子不能與Pb2+適配體結(jié)合,所以Apt與cDNA仍呈雙鏈,MB信號沒有衰弱。證明該方法對Pb2+有較強(qiáng)的特異性。

        圖7 傳感器對10 000 μg/L Pb2+、Mn2+、Fe2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+、Ca2+的檢測結(jié)果Fig.7 Analysis results of 10 000 μg/L of Pb2+,Mn2+,F(xiàn)e2+,Cd2+,Cu2+,Zn2+,Cr3+,Ca2+by the sensor

        2.7 實際樣品的檢測

        為了考察所構(gòu)建的適配體電化學(xué)傳感器的實際測定效果,利用所建立的方法分別對牛奶和湖水樣品中Pb2+含量進(jìn)行加標(biāo)回收測定。將不同濃度的Pb2+添加到處理好的牛奶及小蠡湖水樣品中進(jìn)行DPV檢測,結(jié)果如表1所示。由實驗結(jié)果可知,當(dāng)Pb2+加標(biāo)水平分別為0.400、20.0、50.0×103μg/L時,牛奶樣品的回收率分別為87.1%、115%、97.6%,湖水樣品的回收率分別為107%、106%、108%,證明本方法在牛奶及湖水樣品檢測中具有良好的應(yīng)用效果。

        表1 牛奶和湖水樣品中Pb2+的檢測(n=3)Table 1 Detection of Pb2+in milk and lake water samples(n=3)

        3 結(jié)論

        本研究基于雜交指示劑亞甲基藍(lán)(MB)構(gòu)建了一種無需標(biāo)記、便捷靈敏的適配體電化學(xué)傳感器,用于重金屬Pb2+的檢測。在最優(yōu)條件下,Pb2+的可檢測范圍為0.1~100 000 μg/L,檢出限為33.4 ng/L。傳感器對牛奶樣品和湖水樣品中Pb2+的檢測均展示出良好的實用性。本方法不僅為Pb2+的檢測提供了一個快速便捷、成本低廉的電化學(xué)檢測平臺,也可將其推廣到其他重金屬離子的快速檢測中,具有廣泛的應(yīng)用前景。

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