張雨婷，陳灝翰，李 惠，王曉麗，周楠迪

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

鉛離子（Pb2+）作為毒性最強(qiáng)的重金屬污染物之一，其污染環(huán)境后難以自然降解或無害化，進(jìn)入有機(jī)體后有較強(qiáng)的生物蓄積毒性，會對環(huán)境安全和人類健康造成巨大威脅［1-2］。因此，開發(fā)一種簡單、可靠的Pb2+檢測方法對于環(huán)境和人類健康均有著至關(guān)重要的作用。目前Pb2+的傳統(tǒng)檢測方法主要有原子吸收光譜法［3］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）［4］、表面等離子共振法［5］等。這些方法雖準(zhǔn)確可靠，但存在著操作繁瑣、儀器昂貴、基質(zhì)干擾嚴(yán)重、需要專業(yè)人員操作等缺點，限制了其實際應(yīng)用尤其是在線快速分析領(lǐng)域的應(yīng)用［6-7］。為克服上述困難，研究者們運用熒光法［8］、比色法［9］、電化學(xué)發(fā)光法［10］、電化學(xué)分析法［11］等方法實現(xiàn)了對Pb2+的檢測。隨著近年來微電子技術(shù)的發(fā)展和新材料的應(yīng)用，電化學(xué)傳感器以其高靈敏度、便攜性及低成本等優(yōu)點受到了廣泛關(guān)注。

電化學(xué)傳感器是以酶、抗體、適配體、細(xì)胞等為特異性識別元件，通過對待測目標(biāo)捕獲后電極表面電子傳遞能力變化的檢測，從而將待測物質(zhì)的濃度信號轉(zhuǎn)換成電信號進(jìn)行定量分析［12-13］。對比其他識別原件，適配體作為一類能夠特異性識別小分子、蛋白分子甚至細(xì)胞的寡核苷酸片段，因其高穩(wěn)定性、低成本和多功能性而越來越多的應(yīng)用于檢測分析領(lǐng)域［14-15］。Abu-Ali等［16］利用末端修飾電化學(xué)信號分子的適配體作為識別原件，當(dāng)與Pb2+結(jié)合后，DNA構(gòu)象改變并引起信號分子與電極表面距離的變化，從而引起電化學(xué)信號改變，實現(xiàn)Pb2+的定量檢測。董杰等［17］利用PtNPs@Cu-MOF信號探針和DNA walker信號放大技術(shù)開發(fā)了一種靈敏檢測Pb2+的電化學(xué)傳感器。然而無論是電化學(xué)活性分子還是納米探針作為信號標(biāo)記的適配體傳感器，均需在適配體末端修飾信號分子，使得傳感器構(gòu)建需花費大量成本和精力。

適配體由于本身結(jié)構(gòu)的特殊性，在信號檢測方面展示出其他生物識別原件無可比擬的優(yōu)異性能，不僅可以通過末端修飾信號基團(tuán)引入可檢測信號，還可通過指示劑吸附插入等方式構(gòu)建無需提前信號標(biāo)記的檢測方法，大大降低了傳感器的制備成本和操作難度［18-19］。亞甲基藍(lán)（MB）作為一種有機(jī)染料分子，可定向插入DNA互補(bǔ)配對形成的雙鍵之中，且其具備良好的電化學(xué)活性，因此經(jīng)常作為一種電信號探針應(yīng)用于電化學(xué)適配體傳感器中［20-21］。

本研究通過將Pb2+適配體修飾于電極表面，并與其cDNA通過堿基互補(bǔ)配對形成雙鏈的形式吸附雜交指示劑MB作為電化學(xué)信號物質(zhì)，利用適配體對重金屬Pb2+的特異性識別后雙鏈的定量打開，釋放出MB，構(gòu)建了一種基于MB信號“Turn off”的無標(biāo)記適配體電化學(xué)傳感器，為環(huán)境或食品工業(yè)中Pb2+的快速在線分析提供了一種便捷、靈敏的新型分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；三電極系統(tǒng)：工作電極為金電極（AuE，Φ=3 mm）或修飾電極，參比電極為銀/氯化銀（飽和氯化鉀）電極，對電極為鉑絲電極；電子分析天平（賽多利斯BSA224S）；泰坦UC-6超聲波清洗機(jī)（上海泰坦科技股份有限公司）；HH-B11-BS-I恒溫培養(yǎng)箱（上海泰坦科技股份有限公司）；Ultra-low organic型超純水機(jī)（上海淶科儀器有限公司）；KX-79-1型磁力攪拌器（江蘇科析儀器有限公司）；MX-S漩渦振蕩器（美國賽洛捷克公司），CF15RN離心機(jī)（日本日立公司）。

乙酸鉛標(biāo)準(zhǔn)品、氯化鈉、氯化鎂、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸、氯化鉀、氯化鈣、亞甲基藍(lán)、磷酸氫二鉀、硫酸、磷酸二氫鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，上海生工生物工程股份有限公司）；6-巰基己醇（美國Sigma-Aldrich公司）；0．05 μm氧化鋁粉末（浙江理協(xié)儀器公司）。所有試劑若無特殊說明均為分析純，實驗用水為去離子水（18 MΩ·cm）。

所用DNA核酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Pb2+適配體：GGGTGGGTGGGTGGGT，cDNA序列：CACCCTCCCAC。

1.2 金電極預(yù)處理

在食人魚溶液（H2SO4∶H2O2=7∶3）中浸泡15 min，分別在水和無水乙醇中超聲3 min，再在0．3 μm和0．05 μm氧化鋁懸浮液中分別打磨3 min。用水沖凈后在0．5 mol/L硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描（-0．2~1．5 V，掃描速率1 V/s，循環(huán)次數(shù)100次），再用水沖凈，氮氣吹干后備用。

1.3 適配體與金電極孵育

用Tris-HCl緩沖溶液（10 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，pH 7．4）將Pb2+適配體序列（GGGTGGGTGGGTGGGT）及cDNA序列（CACCCTCCCAC）稀釋至目標(biāo)濃度。取5 μL 0．1 μmol/L的鉛離子適配體（Apt）滴加到處理好的金電極表面，室溫下孵育12 h后用Tris-HCl緩沖溶液清洗電極以備后續(xù)使用。將修飾有Apt的金電極浸泡在2 mmol/L 6-巰基己醇（MCH）中，37℃下孵育1 h后用Tris-HCl清洗電極以備后續(xù)使用。

1.4 互補(bǔ)雙鏈的形成及雜交指示劑的吸附插入

取5 μL 1 μmol/L的cDNA滴加至處理好的金電極表面，37℃下孵育2 h與Apt形成雙鏈，再用Tris-HCl清洗電極以備后續(xù)使用。將上述修飾電極浸泡在1．6 mmol/L亞甲基藍(lán)（MB）溶液中，37℃下孵育1 h，MB即吸附到DNA雙鏈中產(chǎn)生電信號。用Tris-HCl清洗電極以備后續(xù)使用。

1.5 傳感器檢測Pb2+的電化學(xué)測試

將上述修飾電極浸泡在含不同濃度Pb2+的Tris-HCl緩沖溶液中，37℃下孵育一段時間后，用3 mL Tris-HCl緩沖溶液和3 mL水沖洗，進(jìn)行電化學(xué)測試。電化學(xué)測試采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，所有測量均在室溫下進(jìn)行。循環(huán)伏安測試（CV）和電化學(xué)阻抗測試（EIS）在含0．1 mol/L KCl的5．0 mmol/L［Fe（CN）6］3-/4-溶液中進(jìn)行，其中，EIS的頻率范圍為10-2~105Hz，振幅為5 mV。差分脈沖伏安（DPV）測試在Tris-HCl緩沖溶液中進(jìn)行，起始電勢-0．5 V，終止電勢0．1 V，振幅0．05 V，脈沖寬度0．05 s，取樣寬度0．016 666 7 s，脈沖周期0．2 s，靜態(tài)時間2 s，DPV測定掃描時間為30 s。

1.6 PAGE凝膠電泳分析

使用電泳儀（美國Bio-Rad）進(jìn)行PAGE凝膠電泳實驗，并通過UV凝膠電泳成像儀（SmartGel 600，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）記錄成像。將混合有6×TEK載樣緩沖液（pH 8．0，50%甘油，0．25%溴酚藍(lán)）的DNA溶液注入12%天然聚丙烯酰胺凝膠中。在1×TBE電泳液（pH 8．0）、120 V恒定電壓電泳分析1 h。凝膠用Gelred核酸凝膠染色液染色后，記錄圖像。

1.7 實際樣品檢測

牛奶樣品：先用20%三氯乙酸將牛奶樣品溶液調(diào)至pH 4．6，在45℃下孵育15 min使蛋白質(zhì)變性后，采用10 000 r/min離心15 min去除沉淀的蛋白，再將不同濃度的Pb2+添加到處理好的牛奶樣品的上清液中，得到含有不同靶標(biāo)濃度的牛奶樣品。

湖水樣品：水樣以8 000 r/min離心15 min，過0．22 μm膜，用10 mmol/L Tris緩沖液調(diào)至pH 7．4，采用本方法進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 適配體電化學(xué)傳感器的工作原理

本研究基于適配體與Pb2+高特異性結(jié)合后，使插入堿基對間的雜交指示劑MB定量游離，從而實現(xiàn)響應(yīng)信號的“Turn off”變化，發(fā)展了一種檢測Pb2+的適配體電化學(xué)傳感器。傳感器的工作原理如圖1所示。首先將Pb2+適配體修飾至金電極，再將與適配體互補(bǔ)的cDNA與適配體進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對。形成雙鏈后，將MB嵌入到DNA雙鏈中。此時，當(dāng)不存在Pb2+時，插入雙鏈間的豐富的MB在DPV掃描中產(chǎn)生較大的峰電流；當(dāng)加入Pb2+時，Pb2+與適配體結(jié)合導(dǎo)致DNA雙鏈解開，雙鏈中MB的吸附數(shù)量降低，電信號降低，從而實現(xiàn)對Pb2+的定量、靈敏檢測。

圖1 基于雜交指示劑的適配體電化學(xué)傳感器檢測Pb2+的原理圖Fig．1 Scheme of aptamer electrochemical sensor based on hybridization indicator for Pb2+detection

2.2 適配體電化學(xué)傳感器的電化學(xué)表征

為評估構(gòu)建的適配體電化學(xué)傳感器的電化學(xué)性能，以［Fe（CN）6］3-/4-作為探針，采用交流阻抗法和循環(huán)伏安法（CV）對制備的傳感器進(jìn)行表征［29］。如圖2A所示，裸電極EIS曲線的半圓直徑很小，表明此時的電極表面被處理干凈，氧化還原探針可以自由在電極表面進(jìn)行電子傳遞。修飾適配體后的EIS曲線阻值達(dá)到860 Ω，這是由于核酸適配體磷酸骨架的電負(fù)性與探針［Fe（CN）6］3-/4-之間的靜電排斥所造成。使用MCH封閉后，修飾電極的阻值升高，這是由于電極表面裸露的點位被封閉后，修飾的適配體DNA鏈從電極表面吸附狀態(tài)變?yōu)橐砸欢ń嵌戎绷⒂陔姌O表面，因此對探針的排斥增加。當(dāng)加入cDNA，其與適配體形成雙鏈后負(fù)電荷進(jìn)一步增加，造成EIS曲線的半圓直徑進(jìn)一步增大。最后當(dāng)適配體捕獲Pb2+之后，cDNA從電極表面釋放，導(dǎo)致電極的電子傳遞阻力降低。

圖2 傳感器構(gòu)建及檢測過程中的EIS表征曲線圖（A）和CV表征曲線圖（B）Fig．2 EIS curves（A）and CV curves（B）during sensor construction and detection

為一進(jìn)步表征電化學(xué)傳感器的修飾與測定過程，在5 mmol/L K4［Fe（CN）6］3-/4-溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描，結(jié)果如圖2B所示。裸電極的CV曲線在掃描范圍內(nèi)出現(xiàn)一對明顯的且峰形尖銳的氧化還原峰，且峰間距小于100 mV，說明此時電極表面光滑潔凈。修飾適配體后，電極表面由于適配體中磷酸骨架的負(fù)電性對氧化還原探針的排斥作用，使得循環(huán)伏安曲線的峰電流降低。以MCH封閉金電極的剩余點位，并采用cDNA與適配體進(jìn)行雜交孵育之后，進(jìn)一步減少了電子傳遞，循環(huán)伏安曲線的峰電流進(jìn)一步減小，峰間距進(jìn)一步擴(kuò)大。當(dāng)加入Pb2+后，適配體捕獲目標(biāo)離子并釋放出cDNA，造成循環(huán)伏安曲線的峰電流值有所上升。此結(jié)果與上述電化學(xué)阻抗表征結(jié)果一致，進(jìn)一步證明電化學(xué)傳感器構(gòu)建成功。

2.3 PAGE凝膠電泳分析

PAGE凝膠電泳被用于直觀驗證傳感方案構(gòu)建的可行性。如圖3所示，泳道1和泳道2分別為Pb2+的適配體（bp為18）和cDNA（bp為11）。當(dāng)Pb2+不存在時，泳道3是由適配體（泳道1）和cDNA（泳道2）組成的雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)Pb2+存在時，適配體與Pb2+特異性結(jié)合而造成雙鏈被破壞，因此泳道4顯示變?nèi)醯碾p鏈電泳帶以及被釋放出的cDNA電泳帶。上述結(jié)果表明，所提出的傳感方案是切實可行的。

圖3 PAGE電泳圖Fig．3 PAGE images

2.4 差分脈沖法檢測Pb2+

在Tris-HCl緩沖溶液中進(jìn)行差分脈沖（DPV）掃描，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，當(dāng)適配體電化學(xué)傳感器（即修飾有Apt-MCH-cDNA的電極）在無目標(biāo)物的緩沖溶液中進(jìn)行DPV掃描時，由于適配體與cDNA堿基互補(bǔ)配對間插入了大量雜交指示劑MB，在-0．23 V出現(xiàn)了MB的信號峰。當(dāng)傳感器與100 mg/L Pb2+孵育后，Pb2+與Apt的結(jié)合使雙鏈解開，釋放出等比例的MB，從而使MB的峰電流降低。

圖4 在空白溶液及100 mg/LPb2+溶液孵育后傳感器的DPV響應(yīng)曲線圖Fig．4 DPV curves of the developed sensor incubated in blank Tris-HCl buffer and Tris-HCl buffer containing 100 mg/LPb2+solution

2.5 實驗條件的優(yōu)化

本文對影響適配體傳感器對Pb2+檢測的相關(guān)實驗條件進(jìn)行優(yōu)化，包括適配體與cDNA的孵育時間、雜交指示劑MB的使用濃度及吸附時間、目標(biāo)物Pb2+的孵育時間等。

2.5.1 適配體與cDNA的孵育時間將1 μmol/L cDNA滴加到修飾有Pb2+適配體的金電極表面，孵育不同時間后進(jìn)行后續(xù)實驗，并進(jìn)行DPV測試，結(jié)果如圖5A所示。當(dāng)孵育時間在30~120 min內(nèi)，電流值隨孵育時間的增大而增大，當(dāng)孵育時間超過120 min后，電流值穩(wěn)定。因此選取120 min為cDNA的最佳孵育時間。

2.5.2 雜交指示劑MB的濃度與吸附時間取1．2、1．4、1．6、1．8、2．0 mmol/L MB進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖5B所示，當(dāng)MB濃度在1．2~1．6 mmol/L之間時，電流值增加較快；當(dāng)MB濃度在1．6~2．0 mmol/L時，電流值增速緩慢。因此取1．6 mmol/L MB進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖5 不同實驗條件對檢測信號的影響Fig．5 Effects of different experimental conditions on detection signal

進(jìn)一步對MB的孵育時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖5C所示，隨著孵育時間的延長，電流值逐漸增高，在120 min時達(dá)到最大值。當(dāng)孵育時間超過120 min后，電流值降低。因此，選取120 min為MB的最佳孵育時間。

2.5.3 Pb2+的孵育時間由于適配體與其目標(biāo)物的特異性結(jié)合需合適的孵育時間，因此，在上述優(yōu)化實驗基礎(chǔ)上，對Pb2+的孵育時間進(jìn)行優(yōu)化。隨著孵育時間的延長，Pb2+與適配體結(jié)合的量增多，MB的DPV掃描峰電流降低（如圖5D所示）。當(dāng)Pb2+孵育時間為60 min時，電流值達(dá)到最低，且隨著時間的增加，電流值趨于穩(wěn)定。因此實驗選取60 min為Pb2+的最佳孵育時間。

2.6 適配體電化學(xué)傳感器對Pb2+的定量分析

在最優(yōu)實驗條件下，將0．1、1．0、10．0、100、1 000、10 000、100 000 μg/L Pb2+與適配體電化學(xué)傳感器進(jìn)行孵育，測定不同Pb2+質(zhì)量濃度下傳感器響應(yīng)的DPV曲線，結(jié)果如圖6A所示?？梢钥闯鲭S著Pb2+質(zhì)量濃度的增加，由于適配體與目標(biāo)物特異性結(jié)合，使得電活性分子MB的數(shù)量逐漸降低，DPV的峰電流值逐漸減小。以DPV的響應(yīng)峰電流值為縱坐標(biāo)，Pb2+質(zhì)量濃度的對數(shù)值（lgρPb2+）為橫坐標(biāo)做圖，可獲得傳感器對Pb2+離子檢測的線性曲線（如圖6B所示）。結(jié)果顯示，在0．1~100 000 μg/L范圍內(nèi)，Pb2+的質(zhì)量濃度的對數(shù)（x，μg/L）與DPV電流值（y）之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-0．150x+1．86，相關(guān)系數(shù)（r2）=0．993，檢出限（S/N=3）為33．4 ng/L。

圖6 不同Pb2+質(zhì)量濃度下適配體電化學(xué)傳感器的DPV曲線以及峰電流值與不同Pb2+質(zhì)量濃度對數(shù)的線性曲線Fig．6 DPV curves obtained at the aptamer electrochemical sensor upon different concentrations of Pb2+（A），calibration curve between peak current and logarithm different concentration of Pb2+（B）

為評估所構(gòu)建檢測方法對目標(biāo)物檢測的特異性，在最優(yōu)實驗條件下對10 000 μg/L Pb2+、Mn2+、Fe2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+、Ca2+進(jìn)行DPV掃描。結(jié)果如圖7所示，由于其他金屬離子不能與Pb2+適配體結(jié)合，所以Apt與cDNA仍呈雙鏈，MB信號沒有衰弱。證明該方法對Pb2+有較強(qiáng)的特異性。

圖7 傳感器對10 000 μg/L Pb2+、Mn2+、Fe2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+、Ca2+的檢測結(jié)果Fig．7 Analysis results of 10 000 μg/L of Pb2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Cd2+，Cu2+，Zn2+，Cr3+，Ca2+by the sensor

2.7 實際樣品的檢測

為了考察所構(gòu)建的適配體電化學(xué)傳感器的實際測定效果，利用所建立的方法分別對牛奶和湖水樣品中Pb2+含量進(jìn)行加標(biāo)回收測定。將不同濃度的Pb2+添加到處理好的牛奶及小蠡湖水樣品中進(jìn)行DPV檢測，結(jié)果如表1所示。由實驗結(jié)果可知，當(dāng)Pb2+加標(biāo)水平分別為0．400、20．0、50．0×103μg/L時，牛奶樣品的回收率分別為87．1%、115%、97．6%，湖水樣品的回收率分別為107%、106%、108%，證明本方法在牛奶及湖水樣品檢測中具有良好的應(yīng)用效果。

表1 牛奶和湖水樣品中Pb2+的檢測（n=3）Table 1 Detection of Pb2+in milk and lake water samples（n=3）

3 結(jié)論

本研究基于雜交指示劑亞甲基藍(lán)（MB）構(gòu)建了一種無需標(biāo)記、便捷靈敏的適配體電化學(xué)傳感器，用于重金屬Pb2+的檢測。在最優(yōu)條件下，Pb2+的可檢測范圍為0．1~100 000 μg/L，檢出限為33．4 ng/L。傳感器對牛奶樣品和湖水樣品中Pb2+的檢測均展示出良好的實用性。本方法不僅為Pb2+的檢測提供了一個快速便捷、成本低廉的電化學(xué)檢測平臺，也可將其推廣到其他重金屬離子的快速檢測中，具有廣泛的應(yīng)用前景。