李鰻亭，韋穎怡，楊 帆，李新春

（廣西醫(yī)科大學 藥學院，廣西 南寧 530021）

MicroRNAs（miRNAs）是一類由17~25個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈RNA，參與轉錄后基因表達調控，在細胞分化、增殖、代謝和凋亡等許多過程中扮演重要的角色［1-2］。研究表明，miRNAs表達水平與癌癥的發(fā)展密切相關，被認為是相關疾病臨床早期診斷和預后的重要標志物［3-4］。

miRNAs具有序列高度同源、豐度低等特點，給其定量檢測帶來嚴重挑戰(zhàn)［5］。目前較為成熟的miRNAs檢測方法主要包括Northern印跡分析［6］、逆轉錄聚合酶鏈反應［7］和微陣列分析等［8］。近年來，微流控芯片技術［9］、局部表面等離子共振［10］、表面增強拉曼散射［11-12］和熒光分析［13-14］等方法被用于miRNA的定量檢測。電化學技術由于操作簡單、靈敏度高、響應速度快、檢測成本低、可微型集成化等優(yōu)點而備受青睞。Zouari等［15］在AuNPs/rGO修飾的SPCEs上組裝巰基標記DNA捕獲探針，將鏈霉親和素修飾的二茂鐵封端的AuNPs與生物素化的檢測探針相結合，作為標記納米載體，在miRNA-21存在下進行“三明治”雜交，實現(xiàn)miRNA-21的高靈敏檢測；Bao等［16］報道了一種雙鏈特異性核酸酶功能化的石墨烯納米陣列/金納米粒子碳墨電極，用于miRNA的動態(tài)、靈敏和實時分析；Wang等［17］開發(fā)了一種基于靶標介導的環(huán)狀鏈置換反應和引物交換DNA擴增反應的雙重擴增策略的非標記電化學生物傳感器，用于檢測外泌體中miRNA；Luo等［18］開發(fā)了一種基于鎖核酸修飾的“Y”形結構的比率型電化學DNA生物傳感器，用于檢測外泌體中miRNA-21。上述方法均具有較高靈敏度，但實驗設計流程略顯繁瑣，耗時耗力。

本文報道了一種非標記、靶標誘導核酸自組裝，且無需酶輔助信號擴增或其他繁瑣雜交鏈反應的電化學傳感方法，用于miRNA-21的超靈敏檢測。當miRNA-21存在時，金電極表面巰基標記的莖環(huán)結構捕獲探針打開，與設計的兩個銜接子Strand-UP鏈、Strand-DOWN鏈，以及miRNA-21互補配對，自組裝成一個“H”型核酸復合結構。同時，利用鐵氰根離子（［Fe（CN）6］3-）調控［Ru（NH3）6］3+/2+氧化還原循環(huán)，實現(xiàn)催化電流信號放大。該生物傳感器對miRNA-21具有極高的檢測靈敏度，對單堿基錯配以及其他miRNA分子具有很強的抗干擾能力，適用于多個細胞系中miRNA-21的定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI650E電化學工作站（上海辰華儀器股份有限公司）；pH酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；TDL-5A臺式低速離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；MICRO17R小型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司，美國）；ME104E萬分之一電子天平（梅特勒-托利多，瑞士）。

除特別說明外，本實驗所用試劑均為分析純。K3［Fe（CN）6］、K4［Fe（CN）6］·3H2O、KCl、NaCl、MgCl2、HCl、H2SO4、無水乙醇、6-巰基己醇（MCH）、三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP，純度≥98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥99．8%）、氯化六氨合釕（［Ru（NH3）6］3+，RuHex）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氧化鋁（Al2O3，0．05 μm，武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司）；MicroRNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；實驗用水為Milli-Q超純水（18．2 MΩ·cm）。DNA序列（見表1）由上海生工生物工程有限公司合成并經高效液相色譜法純化。實驗用緩沖溶液如表2所示。

表1 本實驗使用的核酸序列Table 1 The nucleic acid sequences used in this experiment

表2 本實驗使用的緩沖溶液Table 2 The buffer solutions used in this experiment

1.2 電極的預處理

將2 mm金盤電極在拋光布上用Al2O3粉（粒徑0．05 μm）充分打磨后，依次用水、乙醇、水各超聲1 min。然后將電極置于0．5 mol/L H2SO4中，用循環(huán)伏安法（CV）進行活化（掃速為100 mV/s，電位范圍為-0．25~1．55 V），至形成穩(wěn)定的伏安圖譜。取出電極用水沖洗，氮氣吹干備用。

1.3 非標記miRNA-21電化學傳感器的構建

將50 μL含1．0 μmol/L CP和1 mmol/L TCEP的Buffer-Ⅰ避光處理1 h，取6 μL滴至金電極表面，在室溫下避光孵育2 h。用Buffer-W沖洗金電極盤面，氮氣吹干后將金電極置于200 μL 1 mmol/L MCH溶液中浸泡1 h，封閉殘余的電極位點，然后用Buffer-W沖洗干凈。再將CP/MCH修飾的金電極浸入40 μL Strand-UP、40 μL Strand-DOWN以及40 μL含不同濃度miRNA-21的Buffer-H中，37．5℃孵育12 h，取出電極，用Buffer-W沖洗電極盤面。最后，將金電極置于10 mL Buffer-E-1中5 min，通過靜電吸附［Ru（NH3）6］3+至平衡狀態(tài)，用于后續(xù)電化學信號檢測。測試前向電解池中通10 min氮氣除氧，排除其對電化學測量的干擾。

1.4 電化學測量

電化學檢測采用三電極系統(tǒng)，其中鉑電極為對電極，Ag/AgCl（3 mol/L氯化鉀）電極為參比電極，組裝有核酸納米結構的金電極（直徑2 mm）為工作電極，室溫下測量。DPV電位掃描范圍為0．1~0．6 V，振幅50 mV、脈沖寬度0．05 s、脈沖周期0．2 s，掃描速度為50 mV/s。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

基于靶標誘導自組裝、非標記、電化學-化學偶聯(lián)信號放大的miRNA-21超靈敏電化學檢測示意圖如圖1所示。利用金-硫鍵可將末端修飾巰基的CP固定在金電極表面，CP序列首尾部含有4對C/G堿基對，可形成相對穩(wěn)定的莖環(huán)結構。Strand-UP和Strand-DOWN鏈均含有與CP、miRNA-21部分互補的片段。在無miRNA-21的情況下，由于CP莖環(huán)結構具有熱力學穩(wěn)定性，Strand-UP和Strand-DOWN不能與金電極表面的CP相互作用形成DNA復合結構，電極表面僅有的莖環(huán)結構未被打開。由于核酸鏈中帶負電荷的磷酸骨架與釕氨離子（［Ru（NH3）6］3+）之間存在靜電作用，［Ru（NH3）6］3+可靜電吸附到CP鏈上，通過DNA介導的電子轉移作用產生很低的背景電流信號。當有miRNA-21時，觸發(fā)CP鏈的莖環(huán)結構打開，CP與Strand-UP、Strand-DOWN以及miRNA-21通過堿基互補配對原則形成一個“H”型的DNA復合結構，為［Ru（NH3）6］3+提供了大量的吸附位點，從而產生較強的電流信號。當測試體系中含有［Fe（CN）6］3-時，［Ru（NH3）6］3+電解還原產物［Ru（NH3）6］2+進一步被［Fe（CN）6］3-氧化，重新生成［Ru（NH3）6］3+，即形成電化學-化學偶聯(lián)循環(huán)，使得［Ru（NH3）6］3+被多次利用，產生高效的催化電流和信號放大效應，實現(xiàn)對miRNA-21的超靈敏檢測［19］。

圖1 一種非標記及催化信號放大的miRNA-21電化學傳感示意圖及信號響應模式圖Fig．1 Schematic diagram and signal response mode of label-free and catalytic current amplified electrochemical sensing of miRNA-21

2.2 電極修飾表征

采用電化學阻抗圖譜（EIS）對電極修飾過程進行表征，高頻區(qū)域為電子轉移控制過程，其中半圓形弧線直徑對應電荷轉移阻抗。如圖2所示，在5 mmol/L K3［Fe（CN）6］+5 mmol/L K4［Fe（CN）6］體系（即Buffer-E-2）中，裸金電極在高頻區(qū)域僅有一個非常小的半圓弧線，電荷轉移阻抗約為140 Ω（曲線a），表明在金電極表面具有快速的電子傳遞過程。當電極修飾了CP后，電荷轉移阻抗增大到約2 070 Ω（曲線b），這是由于DNA帶負電荷，與［Fe（CN）6］3-/4-電化學對之間存在靜電排斥，表明CP通過金-硫鍵連接到金電極表面。用MCH封閉金電極表面多余的活性位點后，電荷轉移阻抗進一步增大到10 530 Ω（曲線c），這是由于MCH會阻礙［Fe（CN）6］3-/4-與電極界面的接觸和電子交換。當無靶標存在時，電荷轉移阻抗約為10 900 Ω，這是因為引入Strand-UP和Strand-DOWN后，不能形成穩(wěn)定的DNA雙鏈結構，因此不會改變電極表面狀態(tài)（曲線d）。當靶標存在時，由于形成DNA-RNA復合結構，嚴重阻礙了電子交換過程，導致電荷轉移阻抗顯著增大至17 500 Ω（曲線e）。以上結果表明已在金電極上成功識別miRNA-21并自組裝形成核酸復合結構。

圖2 電極修飾過程中電化學阻抗譜的變化Fig．2 Electrochemical impedance spectroscopy tracing the modification process of gold electrode

2.3 捕獲探針的組裝密度

金電極表面CP的組裝密度對形成H型DNA復合結構的影響較大，進而會影響電化學信號響應。因此采用計時電量法（CC）檢測不同濃度CP在電極上的組裝密度［20］。當用CP修飾的電極置于含有多價氧化還原陽離子和低離子強度電解質中時，氧化還原陽離子與天然電荷補償陽離子交換并在該界面處被靜電捕獲。計時庫侖法（Chronocoulometry）可以方便地將基于擴散的RuHex氧化還原過程與表面限制的RuHex氧化還原過程分開，由于雙電層和其他吸附在電極表面上的物質的反應引起的電量，不同于由于擴散到電極表面的氧化還原分子反應產生的電量。因此，采用計時庫侖法可對DNA上吸附的陽離子（［Ru（NH3）6］3+）氧化還原電量進行測量，從而計算出CP分子的組裝密度。積分電量Q，作為計時庫侖實驗中時間t的函數由積分Cottrell表達式給出，公式如下：

式中，n是電子轉移數，F(xiàn)是法拉第常數，A是電極面積（cm2），D0是擴散系數（cm2·s-1），C0是體積濃度（mol/cm2），Qdl是電容電荷（C），nFAΓ0是吸附的氧化還原標記的Γ0（mol/cm2）還原產生的電荷。Γ0表示限制在電極表面附近的RuHex的量，Q總電荷包含電容電荷和吸附的反應物電荷。計時庫侖截距（在t=0時）表示限制在電極表面的氧化還原分子RuHex的電荷。由于RuHex對DNA的完全電荷補償，表面限制的氧化還原分子數可轉換為DNA探針密度，關系如下：

式中，ΓDNA是探針表面密度（mol/cm2），m是探針DNA中的堿基數，Z是氧化還原分子的電荷數（Z=1），NA是阿伏伽德羅常數。圖3A給出了CP修飾電極在Tris緩沖液中的計時庫侖圖，通過對比這兩種情況（即Tris緩沖液中是否含有50 μmol/L RuHex）的氧化還原電量，可計算出修飾電極上CP探針的組裝密度。從圖3B可以看出，當CP濃度為0．7 μmol/L時，其組裝密度相對較高，濃度達到1．5 μmol/L時，CP組裝密度下降較為明顯，這是由于過高濃度的DNA單鏈之間會產生一定的空間位阻，不利于DNA自組裝單層的形成。

圖3 電化學傳感器在加入RuHex前后緩沖溶液中的計時庫侖圖（A），及不同濃度CP在金電極上的組裝密度（B）Fig．3 Chronocoulometry signal response of the electrochemical sensor in buffer without or with RuHex（A），and comparison of the assembly density of CP on gold electrode（B）

2.4 實驗條件的優(yōu)化

為獲得最優(yōu)實驗條件，提高檢測靈敏度，對CP濃度、Strand-UP/Strand-DOWN與CP濃度比及核酸組裝時間進行優(yōu)化。采用微分脈沖伏安法（DPV）檢測電流信號的改變：S%=（ImiRNA-21-I0）/I0×100%，式中S%為電流信號的改變，ImiRNA-21為miRNA-21存在時的峰電流值，I0為無miRNA-21時的峰電流值，其中靶標miRNA-21濃度固定為100 pmol/L。

2.4.1 CP濃度的優(yōu)化CP濃度會影響其在金電極表面的組裝密度，進而影響DNA復合結構的生成效率。如圖4A所示，當CP濃度從0．2 μmol/L增加到1．0 μmol/L時，信號增幅逐漸增大，繼續(xù)增加CP濃度至1．5 μmol/L，則S%降低。這是由于當電極表面CP濃度過高時，會產生較大的空間位阻，致使兩個銜接子鏈和miRNA-21不能有效形成穩(wěn)定的H結構；CP濃度過低時，則生成的H結構較少，吸附的釕氨離子數量有限，電流信號弱，靈敏度低。因此，實驗選擇1．0 μmol/L CP作為最佳固定探針濃度。

圖4 CP濃度（A）、Strand-UP/Strand-DOWN與CP的濃度比（B）及孵育時間（C）對信號響應的影響Fig．4 Effects of CP concentration（A），concentration ratio of Strand-UP/Strand-DOWN to CP（B），and incubation time（C）on electrochemical signal response

2.4.2 雜交鏈與CP濃度比的優(yōu)化Strand-UP/Strand-DOWN與CP的濃度比會直接影響H型DNA復合結構的形成效率。如圖4B所示，S%在濃度比0~2之間隨比值的增大而增大，繼續(xù)增大濃度比，則S%呈下降趨勢，這是因為當Strand-UP/Strand-DOWN濃度過大時，會增大電極表面的空間位阻，使得CP莖環(huán)結構不能有效打開，阻礙了H型DNA復合結構的形成，導致S%降低。另外，過高濃度的Strand-UP/Strand-DOWN鏈會產生較大的靜電排斥，4條鏈不能有效地識別和互補配對，從而導致S%降低。因此，實驗選擇Strand-UP/Strand-DOWN與CP鏈的濃度比為2作為后續(xù)實驗條件。

2.4.3 孵育時間的優(yōu)化孵育時間直接影響4條核酸鏈雜交反應的進程以及最終H型DNA復合結構的數量，進而影響電化學響應靈敏度。如圖4C所示，S%在4~12 h范圍內隨著時間的延長電流信號逐漸增大，之后呈下降趨勢。因此，實驗選擇12 h作為最佳孵育時間。

2.5 電化學傳感器的性能分析

在優(yōu)化實驗條件下考察了傳感器對不同濃度miRNA-21的響應。測試體系為表2中的Buffer-E-1。如圖5所示，在0．1 fmol/L~0．1 nmol/L濃度范圍內，DPV電流響應值隨著miRNA-21濃度的不斷增加，峰電流增幅與濃度的對數（lgcmiRNA-21）呈良好的線性關系（圖5插圖），其線性方程為S%=19．05 lgcmiRNA-21+331．53，r2=0．995，檢出限（LOD，S/N≥3）為12．8 amol/L。以上結果表明所采用的電化學-化學偶聯(lián)循環(huán)策略可顯著增強電流響應，提高miRNA-21的檢測靈敏度。相較其他miRNA電化學傳感器，本方法具有更低的檢出限（見表3）。

圖5 信號擴增模式下系列濃度miRNA-21的微分脈沖伏安圖Fig．5 DPV curves of the sensor response to serial concentrations of miRNA-21 with signal amplification strategy insert：quantitative calibration curve of the sensor for miRNA-21 assay

表3 miRNA電化學傳感器的性能比較Table 3 Comparison of analytical performance of electrochemical sensors for miRNA assay

2.6 電化學傳感器的特異性分析

為評估制備的電化學傳感器對miRNA-21檢測的特異性，以相同濃度（100 pmol/L）的其他miRNA，包括miRNA-16、miRNA-39，以及不同堿基錯配RNA鏈對該傳感器的抗干擾能力進行考察。如圖6所示，相同濃度水平的miRNA-21可產生164%的電流信號變化，其他潛在干擾物的信號變化比值均低于20%，表明制備的傳感器具有很好的特異性，可以區(qū)分其他miRNA家族成員、多堿基錯配甚至是單堿基錯配RNA序列，這得益于H型核酸復合結構的設計。

圖6 傳感器對miRNA-21測定的選擇性Fig．6 Selectivity of the present sensor for miRNA-21 assay

2.7 細胞裂解液中的miRNA-21檢測

為驗證該方法在復雜生物基質中定量測定miRNA-21的能力，以4種腫瘤細胞如小鼠乳腺癌細胞（4T1）、大細胞肺癌細胞（NCl-H460）、人乳腺癌細胞（MCF-7）、宮頸癌細胞（Hela）和正常人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的細胞裂解物作為分析樣本，濃度分別為9．4×10-14、2．7×10-15、2．9×10-11、3．0×10-13、6．0×10-18mol/L。可以發(fā)現(xiàn)，相對于其他腫瘤細胞，MCF-7細胞中的miRNA-21濃度較高，也明顯高于正常內皮細胞。因此，該方法能夠靈敏地檢測腫瘤細胞中miRNA-21的濃度水平，在相關疾病診斷中具有一定的應用潛力。

3 結論

本研究成功構建了一種靶標介導的無標記且無需酶輔助信號擴增的超靈敏電化學傳感策略。在靶標miRNA-21存在下，CP鏈、Strand-UP鏈與Strand-DOWN鏈在金電極表面可自發(fā)形成H型核酸復合結構，通過鐵氰根離子（［Fe（CN）6］3-）調控［Ru（NH3）6］3+/2+氧化還原循環(huán)，產生電化學-化學級聯(lián)效應，產生高效催化電流，實現(xiàn)了對miRNA-21的超靈敏檢測，最低檢出限為12．8 amol/L，并能有效區(qū)分其他microRNA以及單堿基錯配核酸序列。方法成功用于多種細胞中miRNA-21的定量檢測。該傳感器具有靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬等特點，優(yōu)于目前報道的PCR擴增、滾環(huán)擴增、鏈置換反應等分析策略，為microRNA相關生物醫(yī)學研究和臨床疾病診斷提供了一種新的技術手段。