孫 剛，朱曉辰，賀 旭，畢新嶺

海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）第一附屬醫(yī)院皮膚科，上海 200433

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見(jiàn)的炎癥性皮膚病，其特征是反復(fù)出現(xiàn)濕疹樣病變和劇烈瘙癢，該病可發(fā)生在所有年齡和種族的人群，對(duì)患者及其家庭造成了巨大的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。WHO 數(shù)據(jù)顯示，全世界有至少2.3 億人患有AD，兒童AD 患病率為15%～25%［2］。雷西莫特是咪唑喹啉類(lèi)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn) 干擾素和IL-12 的產(chǎn)生、減少I(mǎi)L-4 和IL-5 的生成，從而促進(jìn)輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）1 反應(yīng)和抑制Th2 反應(yīng)，同時(shí)降低健康人、變應(yīng)性鼻炎及AD 人群的IgE 水平［3］。因此，科研人員嘗試將雷西莫特應(yīng)用于變應(yīng)性疾病，目前已有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)展［4］。本研究通過(guò)對(duì)AD 模型小鼠腹腔注射雷西莫特，觀察其對(duì)AD 的治療效果，并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 卡泊三醇搽劑（丹麥利奧制藥有限公司，批號(hào)H20150664）。小鼠IgE、IL-4、IL-13 ELISA 檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），TRIzol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）。酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司），熒光定量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠（SPF級(jí)）30 只，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2018-0013］，飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2020-0033］。

1.3 動(dòng)物分組及處理 將30 只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、治療組，每組10 只。模型組及治療組小鼠耳部連續(xù)14 d 涂抹卡泊三醇搽劑（每天2 nmol 卡泊三醇）誘導(dǎo)AD 模型，模型組同時(shí)予200 μL PBS 每天腹腔注射、治療組予50 nmol 雷西莫特（溶于200 μL PBS）每天腹腔注射［4］；空白組小鼠不給予任何處理。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 耳部皮損情況 實(shí)驗(yàn)第15 天觀察各組小鼠的耳部皮損紅斑、腫脹及鱗屑情況，同時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠耳厚度。

1.4.2 耳部組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)第15 天，經(jīng)眼眶取血后以頸椎脫臼法處死小鼠，沿耳根部剪下鼠耳。將取下的鼠耳縱向一分為二，一半放入組織固定液中固定并經(jīng)石蠟包埋后切片，通過(guò)H-E 染色觀察真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大細(xì)胞分布情況；另一半放入-80 ℃冰箱備用。

1.4.3 ELISA 檢測(cè)血清IgE、IL-4、IL-13 水平 實(shí)驗(yàn)第15 天，將采集的血液于室溫靜置2 h，4 ℃3 996×g離心15 min，取血清分管凍存于-80 ℃冰箱中備用。按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清IgE、IL-4、IL-13 檢測(cè)。

1.4.4 qPCR 檢測(cè)耳部皮損組織中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、γ 干擾素mRNA 表達(dá) 取-80 ℃凍存的小鼠耳部皮損組織，在液氮中剪切及研磨，采用TRIzol 法提取總RNA，使用Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司）檢測(cè)RNA 濃度及純度。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，以該鏈為模板、GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。采用2-Ct 法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。GAPDH上游引物序列為5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，下游引物序列為5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3'；TSLP上游引物序列為5'-AGAGAAGCCCTCAATGACCAC-3'，下游引物序列為5'-TGAGGTTTGATTCAGGCAGATGT-3'； 干擾素上游引物序列為5'-CTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG-3'，下游引物序列為5'-TGACCTCAAACTTGGCAATACTC-3'。所有引物均由上海擎熙生物科技有限公司合成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，任意兩組間資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠耳部皮損大體情況 空白組小鼠耳部皮膚未見(jiàn)異常（圖1A）；模型組小鼠耳部皮膚明顯腫脹發(fā)紅、毛細(xì)血管擴(kuò)張，其上附有細(xì)小的鱗屑（圖1B）；與模型組相比，治療組小鼠耳部皮膚紅腫、鱗屑明顯緩解，有輕度毛細(xì)血管擴(kuò)張（圖1C）。模型組小鼠耳厚度為（0.48±0.02）mm，與空白組［（0.19±0.01）mm］相比增厚（P＜0.01）；治療組小鼠耳厚度［（0.35±0.02）mm］較模型組變?。≒＜0.01)。

2.2 各組小鼠耳部組織病理學(xué)變化 H-E 染色可見(jiàn)空白組小鼠耳部組織表皮、真皮結(jié)構(gòu)正常，真皮內(nèi)散在少量組織細(xì)胞，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A）；模型組小鼠表皮角化過(guò)度、角化不全，棘層明顯增厚，皮突延長(zhǎng)，棘細(xì)胞間水腫，真皮全層見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血（圖2B）；治療組小鼠表皮角化、棘層增厚較模型組明顯緩解，未見(jiàn)棘細(xì)胞間水腫，真皮內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞及組織細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分布數(shù)量減少（圖2C）。甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)空白組小鼠真皮內(nèi)散在少量肥大細(xì)胞（圖3A），模型組真皮內(nèi)肥大細(xì)胞明顯增多（圖3B），治療組小鼠真皮內(nèi)肥大細(xì)胞較模型組明顯減少（圖3C）。

2.3 各組小鼠血清IgE、IL-4、IL-13 水平 ELISA檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，與空白組相比，模型組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13水平均升高（P均＜0.01），說(shuō)明小鼠AD 模型構(gòu)建成功。與模型組相比，治療組小鼠血清IgE、IL-4、IL-13 水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.4 各組小鼠耳部組織中TSLP、γ 干擾素mRNA表達(dá) qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠耳部組織 中TSLPmRNA 表 達(dá) 量（0.97±0.24）較 空 白組（0.34±0.09）升高（P＜0.01），治療組TSLPmRNA 表達(dá)量（0.80±0.17）與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組小鼠耳部組織中 干擾素mRNA 表達(dá)量（0.81±0.48）與空白組（1.05±0.08）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但治療組γ 干擾素mRNA 表達(dá)量（1.20±0.14）較模型組升高（P＜0.05）。

3 討 論

AD 的病因復(fù)雜，包括遺傳、免疫和環(huán)境等因素，其中皮膚屏障功能異常和免疫功能障礙被認(rèn)為是AD 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。免疫功能障礙相關(guān)的發(fā)病機(jī)制包括血清IgE 水平升高、Th1/Th2 免疫反應(yīng)失衡、Th2 細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)、表達(dá)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原的T 細(xì)胞增加、表皮炎癥性樹(shù)突狀細(xì)胞（包括朗格漢斯細(xì)胞）中Fc 受體Ⅰ及TSLP 表達(dá)增加等［5］?？ú慈寄軌蛘T導(dǎo)小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)表達(dá)TSLP，導(dǎo)致AD 樣皮損；在卡泊三醇誘導(dǎo)的AD小鼠模型中可見(jiàn)表皮增生，真皮內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，皮損處TSLP、IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-10、IL-8 等Th2 細(xì)胞因子表達(dá)增加，同時(shí)小鼠血清中IgE 水平升高［6］。因此，卡泊三醇誘導(dǎo)的動(dòng)物模型很好地再現(xiàn)了AD 免疫功能障礙的特征。本實(shí)驗(yàn)即采用卡泊三醇搽劑誘導(dǎo)AD 模型，觀察雷西莫特對(duì)AD 小鼠的治療效果及可能的作用機(jī)制。

Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）是一種模式識(shí)別受體，是固有免疫的重要組成部分，可對(duì)入侵的病原體產(chǎn)生防御性炎癥反應(yīng)［7］。研究表明，雷西莫特作為T(mén)LR7/8 激動(dòng)劑可誘導(dǎo)細(xì)胞因子如 干擾素、 干擾素和IL-12表達(dá)，從而增加Th1免疫應(yīng)答，同時(shí)抑制Th2 細(xì)胞產(chǎn)生IL-4 和IL-5［8］。本研究中，治療組小鼠耳部皮損腫脹、紅斑、鱗屑情況較模型組改善，耳部皮損組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，肥大細(xì)胞數(shù)量減少，血清IL-4、IL-13水平下降，耳部皮損組織中 干擾素表達(dá)增加。結(jié)果表明腹腔注射雷西莫特可以通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫應(yīng)答反應(yīng)改善小鼠AD 癥狀。

IgE 在哮喘、變應(yīng)性鼻炎、AD 等變應(yīng)性疾病的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用，Th2 細(xì)胞因子有助于激活B 淋巴細(xì)胞促進(jìn)IgE 產(chǎn)生，而IgE 可促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)，兩者可協(xié)同放大皮膚炎癥反應(yīng)［9］。雷西莫特可直接作用于B 淋巴細(xì)胞而抑制IgE 的合成，也可通過(guò)促進(jìn) 干擾素和IL-12 的分泌抑制IgE 的產(chǎn)生［10］。本實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠血清IgE 水平低于模型組，提示腹腔注射雷西莫特可能通過(guò)抑制IgE 分泌改善AD 皮損情況。

TSLP 作為一種細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞和髓系樹(shù)突狀細(xì)胞的活化，參與人和小鼠AD 及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。TSLP 通過(guò)TNF 受體超家族成員4 配體促使樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生CC 趨化因子配體17 及22，招募CD4+Th2，還可以刺激肥大細(xì)胞和自然殺傷T 細(xì)胞活化，從而增加Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生［11］。雷西莫特可下調(diào)TNF 受體超家族成員4 配體的表達(dá)并促進(jìn)IL-10、IL-12 的產(chǎn)生，消除TSLP 相關(guān)樹(shù)突狀細(xì)胞參與的Th2 免疫應(yīng)答，有助于緩解或預(yù)防變應(yīng)性炎癥［12］。本實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠皮損組織中TSLPmRNA 表達(dá)量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腹腔注射雷西莫特可能不會(huì)直接影響TSLP 表達(dá)，其機(jī)制可能與下調(diào)TNF 受體超家族成員4 配體表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腹腔注射雷西莫特可以改善AD 小鼠的皮炎狀況，作用機(jī)制可能與雷西莫特抑制Th2 反應(yīng)、減少I(mǎi)L-4 和IL-13 分泌，增強(qiáng)Th1反應(yīng)、增加 干擾素mRNA 表達(dá)，同時(shí)抑制IgE 的合成有關(guān)，但其發(fā)揮作用的具體通路及不良反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。