馬立婷,田忠慧,李 楊

(復旦大學 生命科學學院,上海 200438)

1998年Fire等[1]首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)RNA干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象,他們發(fā)現(xiàn)向線蟲體內注入雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)可以抑制同源基因的表達。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉錄之后,所以RNAi又被稱為轉錄后基因沉默現(xiàn)象[2]。經過多年的研究,科學家陸續(xù)在植物、昆蟲、真菌以及哺乳動物中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象[3-11]。RNA酶Ⅲ家族成員Dicer蛋白切割dsRNA,產生具有3’端2 nt懸掛末端的21～23 nt小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),雙鏈siRNA解鏈后進入RNA誘導的沉默復合物(RNA-Induced Silencing C omplex,RISC)的核心蛋白Argonaute(AGO)蛋白,介導對同源mRNA的切割作用[12]。然而,研究發(fā)現(xiàn)向哺乳動物細胞導入dsRNA時,較長的dsRNA會激活干擾素反應,還可能會抑制非特異性基因的表達,產生脫靶效應[13-15]。

2001年,Elbashir等[16]首次揭露體外合成的siRNA可以在人源293T細胞和He La細胞中誘導基因沉默。同年Caplen等[17]發(fā)現(xiàn)siRNA能夠直接在哺乳動物細胞中介導RNAi作用,而不會引發(fā)脫靶效應。這些研究成果證明21～25 nt的siRNA是哺乳動物RNAi的重要中間效應因子,因此開發(fā)出高效的siRNA遞送系統(tǒng)是促進RNAi技術發(fā)展的關鍵。

隨著siRNA遞送系統(tǒng)不斷發(fā)展,如何將siRNA安全高效地導入靶細胞依然是該項技術應用的關鍵[18-19]。病毒載體具有感染效率高、感染對象廣泛等優(yōu)點,因此常作為核酸運載工具介導體內或者體外基因沉默[20-22]。常用的病毒載體類型包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒。逆轉錄病毒具有宿主范圍廣泛、持續(xù)表達外源基因、轉染效率高等優(yōu)勢,但是它不能感染非分裂的細胞,且轉移基因片段的容量較小[23];腺病毒宿主范圍廣,表達效率高,但是存在很大的免疫原性問題,注射到機體后很快會被免疫系統(tǒng)識別并清除[24];腺相關病毒介導的外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達,但是病毒包裝容量小,且純化和給藥方式仍需改進[25];慢病毒能夠感染分裂細胞及非分裂細胞,轉移基因片段的容量較大,但是存在生物安全性和包裝效率低等問題[26]。DNA病毒在復制過程中能夠將外源基因隨機整合到宿主的基因組內,存在引起癌變的風險[26],相比之下RNA病毒風險較小[27],這使得RNA病毒載體在應用上具有更大的潛力。

野田村病毒(Nodamura Virus,No V)是Nodaviridae家族的成員,其基因組由兩條正鏈RNA組成:RNA1編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase,Rd RP)的重要催化亞基蛋白A,RNA2編碼衣殼蛋白前體。在病毒復制過程中,RNA1可以轉錄出亞基因組RNA3,其編碼非結構蛋白B1和B2[28]。No V能夠感染庫蚊、乳鼠、豬等動物,是目前同屬病毒中唯一在自然狀態(tài)下既能感染昆蟲又能感染哺乳動物的病毒[29-31]。No V基因組結構簡單,易于進行反向遺傳學操作,感染的宿主范圍廣,現(xiàn)已作為良好的病毒工具被廣泛應用于各種研究[32-35]。

研究表明No V感染鼠源BHK-21細胞時不引起細胞病變[36-37],向BHK-21細胞中轉染RNA1和RNA2即可獲得No V病毒粒子[35,38]。前期實驗證明當向乳鼠腹腔注射野生型No V時,乳鼠在5天后全部死亡,而注射B2缺陷型野田村病毒(No V(ΔB2))后,乳鼠一直保持健康狀態(tài),而且No V(ΔB2)感染的BHK-21細胞和乳鼠中可以檢測到大量病毒來源的siRNAs(virus-derived siRNAs,vsiRNAs),這些vsiRNAs可以結合AGO蛋白切割同源病毒基因,從而使No V(ΔB2)被快速清除[39-40]?；谇捌趯嶒灲Y果,本實驗旨在以No V(ΔB2)作為病毒載體,攜帶目的基因片段,產生靶向目的基因的siRNA從而抑制其表達。

本研究以EGFP為靶基因,結合病毒基因組的大小,考慮到病毒包裝容量等因素,因此選擇EGFP的部分基因片段作為嘗試,將EGFP基因5'端不包含起始密碼子的214 bp片段(E214)作為目的基因片段包裝入病毒載體中,從而構建出以No V(ΔB2)為載體的siRNA遞送系統(tǒng),并通過深度測序證明該系統(tǒng)能在哺乳動物體內產生靶向EGFP的siRNA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

本研究使用的細胞BHK-No V_B2,BHK-Ebola_VP35由本實驗室保存,使用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),添加10%胎牛血清(FBS)及1%的青霉素-鏈霉素雙抗,于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 試劑

實驗中所用抗體均由本實驗室保存,大腸桿菌E.coliTrans5α感受態(tài)細胞購自Trangene公司,Ifnar1/2雙缺陷型C57BL/6鼠(AG6)由中國科學院上海巴斯德研究所冷啟彬教授饋贈,高保真PCR聚合酶,反轉錄試劑,熒光定量試劑,同源重組試劑均購自南京諾唯贊生物科技有限公司;TransIT?-mRNA Transfection Kit購于Mirus公司;Vaccinia Capping System,NheⅠ-HF酶購于New England Biolabs公司。

1.2 方法

1.2.1 p MT-RNA1-E214及p MT-RNA1(ΔB2)-E214重組載體的構建

No V(ΔB2)是通過將RNA1的P2745、P2754、P2757三處進行點突變得到的B2蛋白表達缺陷型病毒,其突變位點不影響重組載體構建。將E214基因片段構建至RNA1的序列末端(圖1)。

圖1 重組質粒構建Fig.1 Construction of recombinant plasmid

通過PCR法在p MT-RNA1和p MT-RNA1(ΔB2)的序列末端引入NheⅠ酶切位點(圖1(a),引物序列見表1中p MT-No V_RNA1-NheⅠ-F和p MT-No V_RNA1-NheⅠ-R);通過PCR法擴增得到E214片段(圖1(b),引物序列見表1中EGFP-F和EGFP-R);將NheⅠ酶切線性化的載體與E214片段同源重組構建出p MT-RNA1-E214及p MT-RNA1(ΔB2)-E214重組質粒。

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

1.2.2 體外轉錄獲得RNA1-E214、RNA1(ΔB2)-E214以及RNA2

通過PCR法,以p MT-RNA1-E214,p MT-RNA1(ΔB2)-E214,p MT-RNA2為模板,擴增得到含有T7啟動子序列的DNA片段T7-RNA1-E214,T7-RNA1(ΔB2)-E214,T7-RNA2(引物序列見表1中T7-No V_RNA1-F和T7-No V_RNA1-R;T7-No V_RNA2-F和T7-No V_RNA2-R),以上述DNA片段為體外轉錄模板,使用Invitrogen公司的MEGAscript?Kit進行體外轉錄和純化(方法見產品說明書),使用New England Bio Labs公司的Vaccinia Capping System對體外轉錄得到的RNA進行加帽(方法見產品說明書)得到重組病毒的基因組RNA:RNA1-E214,RNA1(ΔB2)-E214以及RNA2。

1.2.3 RNA轉染

提前18～24 h鋪細胞于六孔板,實驗方法見試劑(TransIT?-m RNA Transfection Kit)說明書。

1.2.4 反轉錄和熒光定量PCR檢測病毒核酸水平

使用TRIzol法提取樣品總RNA,取1μg RNA使用Vazyme公司的HiScript?Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄得到cDNA,將cDNA稀釋并使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行qPCR檢測,使用基因特異性引物進行擴增,以Actin基因作為內參,引物序列見表2。

表2 熒光定量引物Tab.2 Primers for fluorescent quantitative

1.2.5 Western blot

用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測相關蛋白表達,轉膜,封閉,加入一抗,二抗,結束后加入顯影液,用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行顯影。

1.2.6 在BHK-No V_B2細胞,BHK-Ebola_VP35細胞中包裝重組病毒

(1) 向細胞轉染1μg RNA1-E214/RNA1(ΔB2)-E214和2μg RNA2,轉染8 h后補加3 m L完全培養(yǎng)基,置于30℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d后收樣,樣品記為第1代。

(2)Western blot檢測第1代樣品中Rd RP,Capsid,B2蛋白表達情況。

(3) 將第1代樣品提取的總RNA再次轉染細胞進行病毒包裝,4 d后收樣,樣品記為第2代。

(4) 重復RNA提取和轉染,直到Western blot檢測到明顯的Rd RP,Capsid,B2蛋白表達為止。

(5) 對相應代數(shù)的總RNA樣品進行RT-PCR,通過設計B2-E214上下游附近引物對E214片段進行檢測(序列見表1中No V_B2-E214-F和No V_B2-E214-R),TA克隆測序驗證重組序列。

1.2.7 小鼠感染重組病毒,方法及劑量參考前期實驗結果[35]

(1) 收集含包裝好的重組病毒的細胞培養(yǎng)液,凍融3次,12 000g離心10 min取上清病毒液。

(2) 通過腹腔注射,將50μL病毒液(含7×106拷貝的No V RNA1)的注射到7日齡AG6乳鼠中。

(3) 觀察小鼠狀態(tài),取后腿肌肉組織,TRIzol法提取RNA和蛋白質。

(4)Western blot檢測病毒蛋白表達情況;RT-qPCR對病毒基因組進行定量,引物序列見表2;RTPCR檢測E214重組情況。

2 結果與分析

2.1 構建重組質粒

用限制性內切酶NheⅠ酶切質粒p MT-RNA1和p MT-RNA1(ΔB2),并通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物(圖2(a)),PCR擴增產物E214(圖2(b))。通過將上述DNA片段進行同源重組得到質粒p MTNo V_RNA1-E214,p MT-No V_RNA1(ΔB2)-E214質粒。重組質粒經測序確認正確。

圖2 重組片段鑒定Fig.2 Identification of recombinant fragments

2.2 體外轉錄NoV基因組

p MT-No V_RNA1-E214,p MT-No V_RNA1(ΔB2)-E214,p MT-No V_RNA2經過PCR、體外轉錄、RNA純化、加帽修飾、RNA純化得到基因組RNA1-E214,RNA1(ΔB2)-E214以及RNA2。經瓊脂糖凝膠電泳(圖3)檢測,轉錄出的RNA在每一個過程中均保持完整未降解。

圖3 體外轉錄產物鑒定Fig.3 Identification of in-vitro transcripts

2.3 BHK-NoV_B2細胞拯救重組病毒及AG6乳鼠感染實驗

將體外轉錄加帽后得到的RNA1(ΔB2)-E214和RNA2,RNA1-E214和RNA2共轉染到穩(wěn)定表達No V-B2蛋白的BHK細胞系(BHK-No V_B2細胞)中,進行兩輪擴增得到重組病毒(No V(ΔB2)-E214-FB2和No V-E214-FB2),均檢測到了No V的RdRp,Capsid蛋白,以及細胞穩(wěn)定表達的B2蛋白,拯救RNA1-E214和RNA2的細胞中還檢測到了B2-E214融合蛋白(圖4)。上述實驗結果表明在BHK-No V_B2細胞中成功拯救重組病毒。

圖4 在BHK-No V_B2細胞中拯救No V(ΔB2)-E214-FB2和No V-E214-FB2Fig.4 Rescue of No V(ΔB2)-E214-FB2 and No V-E214-FB2 in BHK-No V_B2 cells Western blot檢測NoV的RdRp,Capsid,B2蛋白表達情況.

將BHK-No V_B2細胞第2輪拯救出的No V(ΔB2)-E214-FB2培養(yǎng)上清液腹腔注射到AG6鼠中,兩只鼠均第4天死亡,在其后腿肌肉組織中檢測到Rd Rp,Capsid蛋白,但同時還檢測出No V(ΔB2)-E214-FB2無法表達的B2蛋白(圖5(a)),這些野生型B2可能來自于細胞源的B2 mRNA和重組病毒發(fā)生了重組所致。同樣將BHK-No V_B2細胞第2輪拯救出的No V-E214-FB2培養(yǎng)上清液腹腔注射到AG6鼠中,分別在第2天和第5天取樣,第2天檢測到微弱的B2-E214表達;第5天檢測到RdRp,Capsid以及B2-E214重組蛋白,同時檢測到缺失了E214片段的B2蛋白(圖5(b))。

圖5 AG6乳鼠注射BHK-No V_B2細胞來源重組病毒的蛋白水平Fig.5 Protein level of AG6 suckling mice injected with recombinant virus from BHK-No V_B2 cell

2.4 BHK-Ebola_VP35細胞拯救NoV(ΔB2)-E214-FVP35及AG6乳鼠感染實驗

為了防止病毒通過重組細胞來源的B2 m RNA而恢復成野生型病毒,我們將RNA1(ΔB2)-E214和RNA2轉染到穩(wěn)定表達Ebola_VP35蛋白的BHK細胞系(BHK-Ebola_VP35)中,做兩個重復組(#1和#2),直到第3輪擴增之后才檢測到Rd Rp,Capsid蛋白,并且沒有檢測到B2蛋白(圖6,見第632頁)。將第3輪擴增No V(ΔB2)-E214-FVP35的BHK-Ebola_VP35細胞培養(yǎng)上清液腹腔注射到7日齡AG6乳鼠中,分別于第2,3,5,6,7天取乳鼠后腿肌肉樣本,然后對后腿肌肉組織中No V基因組RNA1進行熒光定量檢測,結果顯示乳鼠在接毒后第2天后有較高的病毒積累量,第3,5,6,7天檢測到的病毒積累量較低(圖7,見第632頁)。因為該重組病毒為B2缺陷型病毒,當去除病毒的抑制蛋白B2時,小鼠體內的抗病毒RNAi系統(tǒng)會將病毒逐步清除,因此后續(xù)病毒積累量較低。

圖6 在BHK-Ebola_VP35細胞中拯救No V(ΔB2)-E214-FVP35Fig.6 Rescue of No V(ΔB2)-E214-FVP35 in BHK-Ebola_VP35 cells Western blot檢測No V的RdRp,Capsid,B2蛋白表達情況。

圖7 AG6鼠注射No V(ΔB2)-E214-FVP35(BHKEbola_VP35細胞來源)的熒光定量結果Fig.7 RT-qPCR results of AG6 suckling mice injected with No V(ΔB2)-E214-FVP35

2.5 感染NoV(ΔB2)-E214-FVP35 AG6乳鼠肌肉組織的vsiRNAs特征

前面實驗結果已經確定了重組病毒的病毒感染情況,我們對感染重組病毒No V(ΔB2)-E214-FVP35第2天的乳鼠肌肉組織樣品進行小RNAs深度測序。經生物信息學分析,后腿肌肉樣品的總siRNA分布符合標準特征(圖8(a),見第632頁),vsiRNA具有22 nt長度富集且正負鏈來源的vsiRNAs的數(shù)量接近(圖8(b)),將21～23 nt的vsiRNA匹配到病毒基因組后,我們發(fā)現(xiàn)E214片段可以產生vsiRNA(圖8(c)),經分析靶向EGFP的vsiRNA占總21～23 nt vsiRNA的15.19%。以上結果表明,重組病毒No V(ΔB2)-E214-FVP35感染乳鼠能夠檢測到vsiRNA,且含有匹配到外源E214片段的vsiRNA。

圖8 感染No V(ΔB2)-E214-FVP35的AG6乳鼠后腿組織中sRNAs的特征Fig.8 Characteristics of sRNAs in hind leg tissue of AG6 suckling mice infected with No V(ΔB2)-E214-FVP35

2.6 檢測重組病毒NoV(ΔB2)-E214和NoV-E214的重組片段完整性

在E214基因片段的上下游設計引物,對細胞和乳鼠組織樣品進行RT-PCR,選取PCR產物進行TA克隆,判斷E214重組情況。經瓊脂糖凝膠電泳檢測,BHK-NoV_B2細胞拯救的重組病毒NoV-E214-FB2第1代和第2代均含有完整的E214片段(圖9(a),泳道6～7),感染對應病毒的AG6乳鼠,第2天的樣品含有完整的E214片段(圖9(b),泳道1),但是第5天出現(xiàn)了不同程度的缺失(圖9(b),泳道2)。BHK-Ebola_VP35細胞拯救的No V(ΔB2)-E214-FVP35重組病毒在細胞水平未出現(xiàn)片段缺失(圖9(a),泳道3～5),AG6乳鼠僅在接毒后第2天檢測到E214片段(圖9(b),泳道3),第3～7天均未檢測到明顯片段(圖9(b),泳道4～7)。我們將上述出現(xiàn)片段缺失的樣品(圖9(b)中的泳道1,2對應的樣品)進行TA克隆后測序,發(fā)現(xiàn)片段缺失的區(qū)域集中在E214片段以及插入位點的上游(圖9(c))。感染小鼠組織中檢測到NoV重組病毒在插入位點附近產生的缺失現(xiàn)象可能是病毒具有某種自我修復機制,控制著病毒的結構和基因組的長度。

圖9 重組病毒No V(ΔB2)-E214-FVP35和No V-E214-FB2的重組片段完整性的檢測Fig.9 Detection of the integrity of No V(ΔB2)-E214-FVP35 and No V-E214-FB2

3 討論

目前RNAi逐漸發(fā)展為一項成熟的基因沉默技術,在植物、昆蟲中能產生序列特異性的RNAi抑制現(xiàn)象[1,11],然而在哺乳動物中dsRNA雖然能誘發(fā)RNAi,但是它還能通過啟動干擾素、蛋白激酶R等途徑非特異性關閉蛋白表達甚至導致細胞凋亡[41-43]。2001年Elbashir等[16]通過直接轉染siRNA成功抑制目的基因的表達,自此siRNA成為哺乳動物中應用最廣泛的RNAi效應物。目前常用的病毒載體包裝操作復雜且存在潛在的致癌風險,現(xiàn)有的siRNA遞送技術仍然不夠成熟。

野田村病毒屬的病毒基因組簡單且感染宿主類型多樣,被廣泛用于病毒相關的研究,其中具有代表性的是Flock House Virus(FHV),FHV可以作為載體在植物、昆蟲等細胞中表達外源基因:Dasgupta等[44-45]成功以FHV基因組為載體,在果蠅細胞和成年蚊子中表達GFP,證明了基于FHV的載體在蚊子和其他昆蟲中表達外源基因的潛力,Taning等[46]發(fā)現(xiàn)在FHV基因組中插入外源序列可在受感染的細胞中產生特異性的RNAi效應。由于FHV不能感染哺乳動物,而No V是同屬病毒中唯一能夠感染哺乳動物的病毒[30],因此我們選用No V作為siRNA遞送系統(tǒng)的病毒載體。前期結果表明No V(ΔB2)病毒感染新生乳鼠時,在乳鼠體內可以產生大量的vsiRNAs,這些vsiRNAs進入AGO蛋白,可以特異性抑制同源病毒復制[35,40]。目前重組外源基因的No V拯救實驗還未見報道,本研究構建了以No V、No V(ΔB2)為載體的新型siRNA呈遞系統(tǒng),在BHK-No V_B2和BHK-Ebola_VP35細胞中成功拯救出重組病毒No VE214和No V(ΔB2)-E214,且重組病毒能夠有效感染AG6乳鼠;在感染No V(ΔB2)-E214-FVP35的AG6乳鼠肌肉組織中可以檢測到匹配到外源E214片段上的vsiRNA,證明該系統(tǒng)具有特異性抑制目的基因表達的良好潛力。

在我們初期的實驗中,從穩(wěn)定表達B2抑制子的細胞中成功拯救出No V-E214-FB2和No V(ΔB2)-E214-FB2重組病毒,但是在感染乳鼠后都能檢測到野生型的B2蛋白,這些野生型B2可能來自于細胞源的B2 m RNA和重組病毒發(fā)生了重組所致,這種恢復突變往往會對后續(xù)試驗造成影響。該現(xiàn)象可以通過表達異源的抑制子蛋白得到改善。確實,當我們在穩(wěn)定表達異源抑制子蛋白VP35蛋白的細胞中拯救No V(ΔB2)-E214-FVP35重組病毒成功后,沒有檢測出野生型的B2蛋白,說明異源抑制子的拯救系統(tǒng)是合理可行的。野生型病毒中插入異源RNA片段,會對病毒本身的一些基因組二級結構或者功能造成某些影響,病毒會在復制過程中進行一定的自我修復。我們的實驗結果也證實了這一點,從感染小鼠組織中可以檢測到重組的No V病毒在插入位點附近產生了一定的缺失現(xiàn)象,這種缺失會影響到插入外源片段的完整性,從而造成產生目的siRNA的豐度變低。那么在野生型No V病毒中插入異源片段的大小和位置都需要進行大量的嘗試,最終找到一些最優(yōu)的插入位點和適合的插入長度范圍,最大程度提高外源siRNA的遞送能力。另外,No V病毒本身的一些生物學特征也需要進一步了解,比如病毒特異性感染的組織,感染效率等,這些都會影響到遞送載體的靶向性和效率。