宋志雨，李陶威，張耀勇

漯河市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 漯河 462000

肺癌在中國惡性腫瘤死亡原因中居首位，其發(fā)病率及病死率均高于其他惡性腫瘤[1]。目前肺癌的病理機制還未研究透徹。報道指出，肺癌的形成與細胞內(nèi)關(guān)鍵基因突變有關(guān)，與癌基因異?；钴S和抑癌基因活性降低或不表達有關(guān)[2]。根據(jù)腫瘤的病理表現(xiàn)及異質(zhì)性可將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。在該分類中，NSCLC占比更高。近年來，NSCLC的治療效果顯著提高，但與醫(yī)師治療期望仍有較大差距。分析原因發(fā)現(xiàn)，首先早期診斷證據(jù)缺乏NSCLC的特異性DNA片段，若知曉分子標記的特點，就可提高早期診斷率，延長患者生存時間；其次放化療對無法手術(shù)的晚期NSCLC患者效果不理想，近些年來針對特定基因突變的靶向治療為腫瘤治療指出了新的方向。但目前僅有少數(shù)專門針對這些突變的靶向藥，受益患者不多；最后制訂不恰當(dāng)?shù)闹委煼椒ㄒ鄷绊懟颊叩纳钯|(zhì)量和健康情況。研究指出，根據(jù)與化療相關(guān)的基因突變制訂治療方法是可行的[3-4]。然而基于現(xiàn)有的基因突變，還存在檢測誤差大等問題。1994年，有學(xué)者將互補DNA（complementary DNA，cDNA）編碼的蛋白質(zhì)統(tǒng)一列入HUGE蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，其中編碼這些蛋白質(zhì)的基因統(tǒng)一被稱為KIAA基因，并在其后面給予4個數(shù)字加以區(qū)分。細胞遷移誘導(dǎo)透明質(zhì)酸酶1（cell migration inducing hyaluronidase 1，CEMIP，也稱 KIAA1199）最初被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳中高表達，近年來的研究表明，KIAA1199與NSCLC的發(fā)展密切相關(guān)，探討KIAA1199在NSCLC患者中的表達有助于準確尋找特異性DNA片段，對評估患者病情和預(yù)后、提高治療效果具有重要意義。本研究探討NSCLC組織中KIAA1199的表達及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年8月至2017年8月漯河市中心醫(yī)院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標準：①首次確診為NSCLC；②入院前未接受過放化療、靶向治療或手術(shù)治療；③術(shù)前檢查排除其他腫瘤。排除標準：①合并遠處轉(zhuǎn)移；②除肺臟外其他臟器衰竭；③轉(zhuǎn)移性肺癌；④具有家族遺傳病史。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入124例患者，其中男 67例，女 57例；平均（58.31±5.28）歲。收集NSCLC組織124例和癌旁組織（距離病灶2 cm以上）124例，標本均由手術(shù)取材獲得。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測KIAA1199表達情況

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測NSCLC組織和癌旁組織中KIAA1199的表達情況，具體步驟如下：①烤片。檢查電烤箱是否完好，預(yù)定溫度為60℃，預(yù)熱完成后烘烤30 min，切片數(shù)量少、形狀小則需適當(dāng)縮減時間。②脫蠟、水化。將烘烤后的切片置于二甲苯溶液中，浸泡5 min后取出，靜置5 min脫蠟。然后置于100%、95%、75%的乙醇溶液中，分別浸泡5 min，完成水化。水化后將切片用流動水沖洗，將乙醇洗去，但注意不能用力沖洗。③高壓抗原修復(fù)。將500 g檸檬酸鈉溶解于2 L蒸餾水中，溶解充分后置于高壓蒸汽鍋，完全浸泡于水中，煮沸。蒸汽鍋出汽后等待2 min，然后關(guān)閉電源，待切片自然冷卻后取出。分兩次浸泡于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，每次5 min。④干燥切片。用免疫組化筆在組織旁畫圈，為預(yù)加試劑固定于切片做準備。然后滴加3%過氧化氫，靜置10 min，再用PBS溶液清洗3次，甩干。⑤一抗孵育。1∶100稀釋一抗，于4℃冰箱中過夜。⑥二抗孵育。分3次浸泡于PBS中，每次3 min。滴加二抗，室溫下靜置30 min，PBS浸泡3次，每次3 min。⑦二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色?，F(xiàn)用現(xiàn)配DAB試劑并滴加，等待1 min后用PBS清洗3次。⑧蘇木素染色，染色30 s后用自來水沖洗1～2次，甩干。⑨脫水、封片。將切片依次置于75%、95%、100%的乙醇中，時間均為3 min，然后在組織中央滴一滴中性樹脂，進行封片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

KIAA1199主要定位于細胞質(zhì)中，陽性為細胞質(zhì)呈黃色。根據(jù)陽性細胞比例及染色強度進行評分。陽性細胞比例評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞比例﹤10%為1分，陽性細胞比例10%～50%為2分，陽性細胞比例51%～80%為3分，陽性細胞比例﹥80%為4分。染色強度評分：未著色計0分，為弱陽性（+）；淡黃色計1分，為陽性（++）；黃色計2分，為強陽性（+++）。陽性細胞比例評分與染色強度評分相乘，≥4分為高表達，﹤4分為低表達。

1.4 觀察指標

比較NSCLC組織和癌旁組織中KIAA1199的表達情況，比較不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199的表達情況。所有患者均隨訪3年，比較KIAA1199高表達和低表達患者的3年總生存率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組織和癌旁組織中KIAA1199表達情況的比較

NSCLC組織中KIAA1199高表達率為74.19%（92/124），明顯高于癌旁組織的35.48%（44/124），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=37.513，P=0.001）。

2.2 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199表達情況的比較

不同年齡、性別NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。腺癌、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199高表達率分別高于鱗狀細胞癌、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199表達情況的比較

2.3 生存情況的比較

KIAA1199高表達患者的3年總生存率為22.83%（21/92），明顯低于KIAA1199低表達患者的53.12%（17/32），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.932，P=0.003）。

3 討論

明確可以預(yù)測預(yù)后的分子標志物對肺癌患者治療方案的制訂和生存期的延長具有重要作用。影響肺癌預(yù)后的原因眾多，機制煩瑣。目前臨床中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可作為評估肺癌患者預(yù)后的重要指標[5]。MMP9表達水平與肺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況相關(guān)。除MMP9外，在肺癌組織的腫瘤浸潤環(huán)境中，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、MMP2等水解酶的活性較高，特別是外周血MMP9水平與肺癌的惡性程度有關(guān)，可為監(jiān)測晚期肺癌患者的病情提供依據(jù)[6]。有研究指出，微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)氧化酶 2（cyclooxgenase 2，COX2）、DNA修復(fù)基因等均與肺癌具有直接關(guān)系，但其判斷預(yù)后的效果不佳[7-8]。肺癌標志物雖然很多，但目前為止還未發(fā)現(xiàn)診斷效能高的分子標志物，盡快找出明確的生物標志物對肺癌早期診斷及預(yù)后評估具有重要意義[9-10]。

KIAA1199基因最先在耳聾患者中發(fā)現(xiàn)，其在聽力障礙者的耳蝸及內(nèi)耳中表達異?；钴S，與患者聽力功能減退存在一定關(guān)聯(lián)，故稱為“耳聾基因”[11-12]。進一步研究指出，結(jié)腸癌組織中KIAA1199表達上調(diào)，涉及WNT通路的多個基因激活，且KIAA1199水平越低，WNT通路對腫瘤發(fā)生的影響越小，越能夠抑制腫瘤進一步發(fā)展[13-15]。除大腸癌外，肝癌、胰腺癌、胃癌細胞中KIAA1199也呈高表達。研究發(fā)現(xiàn)，KIAA1199可與肺癌特異性結(jié)合多肽形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物可提示早期肺癌的浸潤深度[16-18]。

本研究探討了KIAA1199在NSCLC組織中的表達情況及臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中KIAA1199高表達率為74.19%，明顯高于癌旁組織的35.48%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。表明KIAA1199表達情況與NSCLC的發(fā)生有關(guān)。

KIAA1199蛋白可提高細胞耗氧需求進而造成缺氧，促使細胞遷移。同時KIAA1199可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），導(dǎo)致腫瘤細胞進一步擴散，但其對肺癌的具體作用機制仍未研究清楚。研究表明，KIAA1199可干擾WNT通路的活性，通過自身作用改變下游靶分子的功能，提高NSCLC細胞的侵襲能力，加速腫瘤細胞生長，促進正常細胞凋亡[19]。還有研究指出，在NSCLC中，miRNA-486-5p是改變KIAA1199活性的關(guān)鍵因子，其通過促進表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異?；钴S，繼而激活下游信號通路，阻止腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞再生長[20]。以上研究結(jié)果說明，KIAA1199在NSCLC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，腺癌、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199高表達率分別高于鱗狀細胞癌、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。說明KIAA1199表達與NSCLC患者的病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)。KIAA1199高表達NSCLC患者的3年總生存率為22.83%，明顯低于KIAA1199低表達患者的53.12%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01），提示KIAA1199與NSCLC患者的預(yù)后有關(guān)。根據(jù)以上結(jié)果，下一步的研究可分析NSCLC治療效果與KIAA1199表達情況的關(guān)系，根據(jù)KIAA1199的表達情況制訂個性化治療方案，探究是否可以提高療效，改善生活質(zhì)量。而另一方面，KIAA1199低表達患者的病情相對較輕，能否減少化療療程，仍需要進一步的臨床試驗數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，KIAA1199在NSCLC組織中高表達，其與NSCLC患者的臨床特征及預(yù)后有關(guān)，可為預(yù)后評估提供依據(jù)。