牟安攀 金輝

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病。目前肺結(jié)核的診斷金標準是結(jié)核菌培養(yǎng)，但耗時較長（6～8周），其中近20%的患者培養(yǎng)失敗，即使結(jié)合T-SPOT.TB診斷，仍存在較高的誤/漏診率。如一項來自上海的人群調(diào)查報道顯示，部分肺結(jié)核患者感染結(jié)核分枝桿菌后痰液的細菌學涂片呈陰性，結(jié)合TSPOT.TB的診斷特異度亦不足50%[1]，因此，尋找快速有效的診斷肺結(jié)核方法是肺結(jié)核防控的關(guān)鍵[2]。研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核血清中微小RNA-431（microRNA-431，miR-431）、微小 RNA-194-5p（microRNA-194-5p，miR-194-5p）、細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制物1（suppressor of cytokine singaling 1，SOCS1）表達異常[3-5]，且3項指標表達異常均可能與肺結(jié)核疾病的嚴重程度有關(guān)[6]。本研究旨在探討肺結(jié)核患者血清中miR-431、miR-194-5p、SOCS1的表達及其用于診斷肺結(jié)核的效能。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年11月至2020年11月臺州市第一人民醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者45例（肺結(jié)核組）、肺炎患者45例（肺炎組）、肺癌患者45例（肺癌組）及同期在本院體檢中心健康體檢的健康志愿者45名（對照組）作為研究對象。納入標準：肺結(jié)核組患者均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[7]中肺結(jié)核的診斷標準，入院前未服用過抗結(jié)核藥；肺炎組患者均符合《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016版）》[8]；肺癌組患者符合歐洲呼吸學會2011年公布的肺腺癌國際多學科標準中肺癌的診斷標準[9]；研究對象男女不限，年齡≥18歲。排除標準：（1）精神障礙、依從性差者；（2）合并肝、腎、心、腦等臟器功能障礙或器質(zhì)性損傷者；（3）合并意識障礙者；（4）合并自身免疫系統(tǒng)疾病者；（5）近期接受過激素類藥物或免疫抑制劑治療者[10]。4組研究對象性別、年齡、BMI比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有研究對象均知情同意。

表1 4組研究對象基線資料比較

1.2 檢測方法

1.2.1 miR-431、miR-194-5p表達水平檢測 采用RT-PCR法。收集所有研究對象入院時空腹血，離心得血清，采用miR-431提取分離試劑盒（武漢博歐特生物科技有限公司）、miR-194-5p試劑盒（上海易匯生物科技有限公司）、RTFQ-PCR試劑盒（天津銳爾康生物科技有限公司）進行反轉(zhuǎn)錄反應，將cDNA產(chǎn)物進行PCR擴增。條件參數(shù)：95℃預變性10 s，85℃變性5 s，60℃退火/延伸45 s，35個循環(huán)。重復實驗3次。miR-431正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；miR-194-5p 正向引物：5'-ATGTGGACTGTGCTCGGATT-3'，反 向 引 物 ：5'-ACTCGATCAGCTAGCTTACGA-3'。內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）上游引物：5'-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3'，下游引物：5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 計 算miR-431、miR-194-5p mRNA的相對表達水平。

1.2.2 血清中SOCS1表達水平檢測 采用ELISA法。收集所有研究對象入院時空腹血，離心得血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。采用酶標儀（型號：LONZA ELx808，北京澤平科技有限責任公司）檢測波長450 nm處吸光度值，根據(jù)吸光度值與標準品濃度做出標準曲線，并計算患者血清SOCS1表達水平。

1.3 肺結(jié)核組患者臨床病理特征收集 包括性別、年齡、吸煙史、結(jié)核空洞、病灶范圍及疾病分期，分析肺結(jié)核組患者血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達與臨床病理特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。ROC曲線評估m(xù)iR-431、miR-194-5p、SOCS1單獨檢測及聯(lián)合檢測診斷肺結(jié)核的效能。采用Pearson相關(guān)分析miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組研究對象血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達水平比較 肺結(jié)核組患者血清miR-431、miR-194-5p表達水平均高于對照組和肺癌組，低于肺炎組；SOCS1表達水平低于對照組和肺癌組，高于肺炎組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 4組研究對象血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達水平比較

2.2 肺結(jié)核患者血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡的肺結(jié)核患者血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。有吸煙史、有結(jié)核空洞、病灶范圍大、疾病處于進展期與肺結(jié)核患者血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1的表達水平均有關(guān)（均P＜0.05），見表3。

表3 肺結(jié)核患者血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1單獨檢測及聯(lián)合檢測診斷肺結(jié)核的效能 ROC曲線顯示，與血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1單獨檢測及miR-431聯(lián)合miR-194-5p、miR-431聯(lián)合SOCS1、miR-194-5p聯(lián)合SOCS1檢測相比，3項指標聯(lián)合檢測診斷肺結(jié)核的AUC更高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。由此可知，兩兩聯(lián)合檢測的診斷效能均高于單獨檢測，3項指標聯(lián)合檢測診斷效能均高于兩兩聯(lián)合檢測及單獨檢測，見表4和圖1（插頁）。

表4 血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1單獨檢測及聯(lián)合檢測診斷肺結(jié)核的效能

2.4 肺結(jié)核患者血清 miR-431、miR-194-5p、SOCS1表達水平的相關(guān)性分析 肺結(jié)核患者血清miR-431表達水平和miR-194-5p表達水平呈正 相關(guān)（r=0.680，P＜0.01），血清 miR-431、miR-194-5p表達水平與SOCS1表達水平均呈負相關(guān)（r=-0.962、-0.639，均P＜0.01），見圖2。

3 討論

miR-431屬于14q32miRNA基因簇中的小分子RNA，在機體中分布較為廣泛并以保守型非編碼RNA的形式存在，在肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-431在肺結(jié)核中異常高表達，上調(diào)miR-431可調(diào)控肺結(jié)核耐藥相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子熱休克因子1表達，因此miR-431表達與肺結(jié)核耐藥密切相關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，miR-431在肺結(jié)核患者血清中呈高表達。文獻報道顯示，miR-431通過負向調(diào)控機制參與肺部發(fā)育過程，成年人的肺部發(fā)育趨向成熟，因此血清miR-431多呈低表達，一旦表達增高，則提示肺部存在病變。肺結(jié)核患者外周血miR-431多呈高表達，因為miR-431可加速T淋巴細胞的凋亡、增殖和遷移，削弱機體對結(jié)核分枝桿菌的抵制作用[6,11]。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核組患者血清miR-431與對照組、肺癌組及肺炎組均存在差異，肺結(jié)核患者血清miR-431水平介于肺癌組及肺炎組之間，提示血清miR-431可用于鑒別診斷肺結(jié)核，本研究也佐證了文獻報道。

研究表明，miR-194-5p可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進巨噬細胞中相關(guān)炎癥因子表達[12-14]。肺結(jié)核屬于感染性疾病，結(jié)核分枝桿菌感染可誘導細胞中miR-194-5p表達持續(xù)升高，升高的miR-194-5p可強化細胞的抗凋亡能力，促進肺結(jié)核發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，miR-194-5p在肺結(jié)核患者血清中高表達，與患者吸煙史、結(jié)核空洞、病灶范圍、疾病分期等臨床病理特征有關(guān)，且肺結(jié)核患者血清miR-194-5p水平介于肺癌組及肺炎組之間，該結(jié)果提示，下調(diào)miR-194-5p表達可能是有效遏制肺結(jié)核進展的潛在治療方向。

SOCS1屬于細胞因子信號抑制蛋白家族一員，作為負性調(diào)節(jié)因子，SOCS1可通過阻斷相關(guān)信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)免疫反應，在肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵性作用[15]。Carow等[16]研究顯示，SOCS1可減弱結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞調(diào)節(jié)的大多數(shù)基因的表達，上調(diào)SOCS1有助于保護宿主免受感染誘導，降低炎癥反應。本研究結(jié)果亦顯示，與對照組相比，肺結(jié)核組患者血清中SOCS1呈低表達，且與患者疾病分期等多種臨床病理特征密切相關(guān)，加之肺結(jié)核患者血清SOCS1水平介于肺癌組及肺炎組之間，該結(jié)果提示，SOCS1可能是肺結(jié)核潛在的生物標志物，可用于肺結(jié)核的輔助診斷。

綜上所述，肺結(jié)核患者血清miR-431、miR-194-5p表達升高，SOCS1表達降低，3項指標兩兩呈線性相關(guān)，與患者的臨床病理特征相關(guān)。ROC曲線分析3項指標聯(lián)合診斷肺結(jié)核的效能均高于兩兩聯(lián)合檢測或單獨檢測，臨床聯(lián)合檢測血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1水平可用于鑒別診斷肺結(jié)核。但血清miR-431、miR-194-5p、SOCS1在肺部病變或肺結(jié)核病變過程的作用機制仍需要深入研究。