孫銘博 陳水兵

胃癌是全球第二大常見腫瘤，胃腺癌占胃癌的95%[1]。作為最常見的胃癌類型，胃腺癌造成了重大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，其5年總生存率不到20%[2-3]。胃腺癌的靶向治療主要包括抗人表皮生長因子受體2治療、抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療和抗成纖維細(xì)胞生長因子受體治療等；然而，由于不良反應(yīng)，這些藥物在臨床上應(yīng)用受到一定限制[4]。鑒于胃腺癌的高發(fā)病率和高病死率，迫切需要開發(fā)新的治療藥物和治療策略。

近年來，生物信息學(xué)在疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究以及臨床診斷與治療中發(fā)揮著越來越重要的作用[5]。轉(zhuǎn)錄組測序等方法可通過篩選差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)病理狀態(tài)下的基因轉(zhuǎn)錄差異，找出新的生物標(biāo)志物，應(yīng)用于臨床的診斷與治療[6]。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）項(xiàng)目納入了數(shù)千個腫瘤樣本的測序結(jié)果以及生存期等數(shù)據(jù)[7]。本研究中，通過將基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集與生物信息學(xué)分析相結(jié)合，從而明確胃腺癌組織中基因的表達(dá)水平變化，確定存在于差異表達(dá)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因和通路，并在TCGA數(shù)據(jù)庫中探索其與患者預(yù)后的關(guān)系，最后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 胃腺癌差異表達(dá)基因篩選 以“胃腺癌”為關(guān)鍵詞在高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中篩選表達(dá)譜數(shù)據(jù)，獲取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE103236、GSE79973、GSE54129和GSE118916。其中GSE103236數(shù)據(jù)集中包含10例胃腺癌組織樣本和9例正常組織樣本，GSE79973數(shù)據(jù)集中包含10例胃腺癌組織樣本和10例正常組織樣本，GSE54129數(shù)據(jù)集中包含111例胃腺癌組織樣本和21例正常組織樣本，GSE118916數(shù)據(jù)集中包含15例胃腺癌組織樣本和15例正常組織樣本。通過在線工具BioJupies軟件分析上述GSE103236、GSE79973和GSE54129數(shù)據(jù)集獲得差異表達(dá)基因。

1.2 生物學(xué)富集和信號通路富集分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，并進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。GO分析可以明確差異表達(dá)基因在生物過程、分子功能和細(xì)胞組分的生物學(xué)特性[8]；KEGG分析進(jìn)一步明確差異表達(dá)基因在信號通路的富集情況。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用STRING數(shù)據(jù)庫[9]（https://string-db.org/）構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape進(jìn)行可視化。通過CytoHubba插件進(jìn)行關(guān)鍵基因的分析，采用Degree算法篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中連結(jié)度最高的前10個關(guān)鍵差異表達(dá)基因。這些關(guān)鍵基因編碼的蛋白質(zhì)可能與其他蛋白質(zhì)具有高度相互作用，并處于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置。

1.4 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 使用GSEA軟件對GSE118916數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，以確定與胃腺癌相關(guān)的生物過程，分子特征數(shù)據(jù)庫（MSigDB）作為參考基因集[10]。

1.5 總體生存分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取胃腺癌患者臨床信息的數(shù)據(jù)[11]。使用survminer R包分析這些生物標(biāo)志物基因與胃腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，分別比較這些關(guān)鍵基因高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的總生存期（overall survival，OS）的差異。

1.6 細(xì)胞與藥物試劑 本研究使用的MKN45細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）購自美國MCE公司，UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScript?RT Master Mix購自日本TAKARA公司。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng) 將MKN45細(xì)胞系置于37℃，含有5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用含有10%FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至融合度約60%以上時，添加5-Fu[溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）]或DMSO（對照），處理48 h后提取總RNA并進(jìn)行實(shí)時定量PCR分析。

1.8 Ⅰ型膠原 α1亞基（collagen type Ⅰ alpha1，COL1A1）、Ⅳ型膠原 α1亞基（collagen type Ⅳ alpha1，COL4A1）、血小板反應(yīng)蛋白 1（thrombospondin 1，THBS1）、纖維連接蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）和半胱氨酸的分泌性酸性蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）mRNA表達(dá)水平檢測 采用實(shí)時定量PCR法。使用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取MKN45細(xì)胞的總RNA提取。使用PrimeScript?RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃10 min預(yù)變性；95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，具體引物序列見表1。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 8.3.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選 通過BioJupies軟件對GSE103236、GSE79973和GSE54129數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，與正常組織樣本相比，胃腺癌組織樣本中分別有289、576和763個差異表達(dá)基因，其中有205個是3個數(shù)據(jù)集共有的，包括顯著下調(diào)44個，顯著上調(diào)161個。前40個共有差異表達(dá)基因熱圖見圖1。

2.2 差異表達(dá)基因的生物學(xué)富集分析和信號通路富集分析 GO分析結(jié)果表明，在生物學(xué)過程方面，差異表達(dá)基因主要富集在消化過程、細(xì)胞外基質(zhì)形成、膠原分解代謝過程和細(xì)胞黏附等生物學(xué)過程；在細(xì)胞成分方面，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞外間隙、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、外泌體和細(xì)胞器膜部分；在分子功能方面，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合、肝素結(jié)合和單加氧酶活性視黃醇脫氫酶活性，見圖2。KEGG分析顯示有18條顯著富集的信號通路，主要集中在細(xì)胞色素P450對異生物質(zhì)的代謝（hsa00980）、化學(xué)致癌作用（hsa05204）、藥物代謝-細(xì)胞色素P450（hsa00982）、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用（hsa04512）、視黃醇代謝（hsa00830）、蛋白質(zhì)消化吸收（hsa04974）和胃酸分泌（hsa04971）等信號通路，見圖3。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因的識別 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖4。使用CytoHubba插件篩選差異表達(dá)基因中的關(guān)鍵基因，共得到9個關(guān)鍵基因：COL1A1、Ⅱ型膠原 α1亞基（collagen type Ⅰ alpha2，COL1A2）、COL4A1、Ⅵ型膠原 α3亞基（collagen type Ⅵ alpha3，COL6A3）、THBS1、血小板反應(yīng)蛋白 2（thrombospondin 2，THBS2）、雙糖鏈蛋白多糖（biglycan，BGN）、FN1和SPARC，關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖5。這些關(guān)鍵基因及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)可能在胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。

2.4 對GSE118916數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA 通過比較胃腺癌組織樣本和正常組織樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與胃腺癌相關(guān)的基因主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路、p53信號通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路和視黃醇代謝通路等信號通路，與KEGG結(jié)果基本一致，見圖6。

2.5 9個關(guān)鍵基因高表達(dá)組和低表達(dá)組患者OS比較 通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中前述9個基因表達(dá)不同的患者進(jìn)行OS比較，結(jié)果顯示COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC高表達(dá)組患者OS均短于低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖7。

2.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵基因 對MKN45胃腺癌細(xì)胞系使用5-Fu處理48 h后，COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC等基因表達(dá)水平均降低，表明通過5-FU治療后可降低COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC的表達(dá)，可能與患者預(yù)后改善有關(guān)，見圖8。

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后較差，我國胃癌患者5年生存率低于40%[12]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，這些基因往往與特定的腫瘤組織學(xué)類型有關(guān)[13]。胃癌在組織學(xué)上分為腺癌、腺鱗癌、鱗狀細(xì)胞癌、未分化癌和類癌。胃腺癌是胃癌最常見的組織學(xué)類型，占所有病例的95%，發(fā)病率和病死率較高。胃腺癌患者臨床確診時多為中晚期，術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率較高?；熾m能幫助部分患者改善生活質(zhì)量，延長生存時間，但效果有限[14]。因此，迫切需要基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析來了解胃腺癌的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步尋找新的治療靶點(diǎn)提供思路。本研究表明，通過生物信息學(xué)分析，5個關(guān)鍵基因高表達(dá)與胃腺癌患者預(yù)后差相關(guān)，并且與數(shù)據(jù)庫有較好的一致性。因此，COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1和SPARC與可作為胃腺癌臨床診斷和預(yù)后的新生物標(biāo)志物。

本研究中，通過BioJupies對GEO數(shù)據(jù)庫的3個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集 GSE103236、GSE79973和 GSE54129，共131例胃腺癌組織樣本和40例正常組織樣本進(jìn)行分析，篩選出205個共有的差異表達(dá)基因。對205個共有的差異基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析，這些差異基因主要富集在消化過程、細(xì)胞外基質(zhì)形成、膠原分解代謝過程和細(xì)胞黏附等生物學(xué)過程，以及細(xì)胞色素P450對異生物質(zhì)的代謝、化學(xué)致癌作用和藥物代謝-細(xì)胞色素P450等信號通路上。在對GSE118916數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA分析后，結(jié)果表明，胃腺癌組織樣本的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路、mTOR信號通路、p53信號通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路和視黃醇代謝通路，與KEGG分析的結(jié)果一致。同時，對差異表達(dá)基因構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)COL1A1、COL1A2、THBS2、COL6A3、COL4A1、BGN、THBS1、FN1和SPARC是該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因。為了確定這些關(guān)鍵基因的表達(dá)高低與患者預(yù)后的關(guān)系，在TCGA數(shù)據(jù)庫中胃腺癌患者中進(jìn)行對比。最后，確定了5個與胃腺癌預(yù)后不良相關(guān)的關(guān)鍵基因：COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1和SPARC。臨床中常用5-FU治療胃腺癌患者，可使腫瘤組織減小，遷移和增殖降低。因此，對MKN45細(xì)胞系進(jìn)行5-FU處理48 h后，檢測COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示 COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC mRNA的表達(dá)均有明顯降低。

COL1A1是Ⅰ型膠原蛋白的pro-α1鏈，作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，參與許多生物過程，包括細(xì)胞外基質(zhì)重塑、腫瘤細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移[15]。腹腔注射COL1A1可加速卵巢癌的腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移[16]。此外，干擾COL1A1可抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[17]。COL4A1也是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分之一，也參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和黏著斑通路，并在血管生成、炎癥和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[18]。有研究表明，COL4A1在曲妥珠單抗耐藥的胃腺癌細(xì)胞中高表達(dá)[19]。THBS1表達(dá)與腫瘤血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)[20]。在胃腺癌中，由于THBS1與VEGF呈正相關(guān)，可能起到促血管生成和促炎作用，并且THBS1表達(dá)水平升高與胃腺癌中的腫瘤生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[21]。越來越多的細(xì)胞檢測表明THBS1在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中發(fā)揮著重要的作用。FN1是一種高分子量（440 kDa）的細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞黏附糖蛋白，主要在各種癌組織中表達(dá)[22]，參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、細(xì)胞黏附通路、癌癥通路和內(nèi)皮細(xì)胞存活、增殖、黏附、遷移、炎癥和血管生成。有研究表明，在胃腺癌組織中抑制FN1的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23]。SPARC在不同的腫瘤組織中表達(dá)有所不同。在惡性胸膜間皮瘤中，腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)較高。血清SPARC水平升高往往預(yù)示著患者預(yù)后不良[24]。在不同腫瘤中，SPARC的來源并不相同。在惡性卵巢癌、結(jié)直腸癌和胃癌患者中，SPARC主要來自腫瘤基質(zhì)細(xì)胞[25]。在黑色素瘤和乳腺癌患者中，腫瘤細(xì)胞是SPARC的主要來源[26]，但在胃腺癌的研究中尚不明確。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法分析了胃腺癌發(fā)展的分子機(jī)制，確定了5個關(guān)鍵基因：COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1和SPARC，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)做了初步驗(yàn)證。然而，還需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這些關(guān)鍵基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。