王清清 張杰

肝癌是最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第5位[1]。大多數(shù)肝癌患者就診時(shí)已是中晚期，失去了根治性手術(shù)切除機(jī)會(huì)。索拉菲尼是一種多激酶抑制劑，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減輕血管生成和抑制腫瘤細(xì)胞增殖，是治療中晚期肝癌的一線靶向藥物。但是，臨床發(fā)現(xiàn)患者長(zhǎng)期口服索拉菲尼容易產(chǎn)生耐藥，同時(shí)耐藥后的肝癌細(xì)胞具有增強(qiáng)的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，極大地限制了索拉菲尼的臨床療效。因此，探尋索拉菲尼耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲的機(jī)制對(duì)提高晚期肝癌患者的生存時(shí)間具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在抗腫瘤藥物的耐藥性中起著重要作用[2-4]。本研究采用lncRNA芯片微陣列分析肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞Huh7SR和親本細(xì)胞Huh7中的lncRNA，篩選差異表達(dá)的lncRNA，探討差異表達(dá)的lncRNA對(duì)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞遷移、侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑 人肝癌親本細(xì)胞Huh7購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)液購自美國(guó)Hyclone公司；一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、鈣黏蛋白N（N-cadherin）、鈣黏蛋白 E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）均購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑均購自上海碧云天科技有限公司；CCK-8試劑購自日本Dojindo公司；FBS購自美國(guó)Gibico公司；Transwell小室購自美國(guó)Corning公司；lncRNA ENST00000484679引物及其特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及陰性對(duì)照（RNAi negative control，siNC）均由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本課題組前期已成功誘導(dǎo)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞Huh7SR，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 lncRNA芯片微陣列分析 采用lncRNA芯片微陣列分析肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中的lncRNA，以差異倍數(shù)＞2.0和P＜0.05為篩選條件，篩選出差異表達(dá)的lncRNA，并進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照每孔10×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%，根據(jù)Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組為ENST00000484679-siRNA組，對(duì)照組為siNC組。ENST00000484679-siRNA組加入lncRNA ENST00000484679-siRNA轉(zhuǎn)染，siNC組加入無關(guān)序列NC-siRNA轉(zhuǎn)染，加入Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑后混勻，室溫孵育20 min，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.5 各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000484679、ENST-00000484679 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞中總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增。引物序列如下，lncRNA ENST 00000484679上游引物：5'-CCGTGAATATGGACAAGTGGAA-3'，下游引物：5'-CAAGTACCCACACAATATAGAGCAA-3'；ENST00000484679 上 游 引 物 ：5'-CTAGGGCTTTCCAGTTAAA-3'，下游引物：5'-CTCAGGTTTCTAAAGTTAA-3'；GAPDH上游引物：5'-GAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物：5'-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。以GAPDH為內(nèi)參，各組設(shè)置3個(gè)副孔，2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞遷移及侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液重懸經(jīng)過轉(zhuǎn)染的Huh7SR，分為ENST00000484679-siRNA組和siNC組，侵襲實(shí)驗(yàn)提前于24孔Transwell小室包被基質(zhì)膠，上室加入約2×104個(gè)細(xì)胞（200 μl），下室加入含20%FBS的培養(yǎng)液600 μl。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室，用棉簽擦除上層未穿透細(xì)胞，甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)無需包被基質(zhì)膠，余操作步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.7 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標(biāo)記蛋白 N-cadherin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。用胰酶消化轉(zhuǎn)染后的Huh7SR，分為ENST00000484679-siRNA組和siNC組，收集細(xì)胞加入蛋白裂解液（RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑=100∶1），冰上裂解30 min，離心收集上清液，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品中按體積比例加入5×Loading Buffer，100℃恒溫下10 min蛋白變性。制備SDS-PAGE，每孔上樣總蛋白30 μg，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗在4℃下孵育過夜，PBST洗滌，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h，PBST洗滌，加入ECL顯影液，凝膠成像系統(tǒng)顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞差異表達(dá)的lncRNA篩選及其熒光定量PCR驗(yàn)證 lncRNA芯片微陣列分析共得到肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株和親本細(xì)胞株中差異表達(dá)的lncRNA 1 636個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)905個(gè)，表達(dá)下調(diào)731個(gè)，lncRNA ENST00000484679的表達(dá)差異倍數(shù)最大，見圖1。為了驗(yàn)證芯片的結(jié)果，筆者篩選了6個(gè)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞之間表達(dá)差異倍數(shù)最大的lncRNA進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果顯示Huh7SR細(xì)胞lncRNA ENST00000484679 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)大于Huh7細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

2.2 兩組肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞中ENST00000484679 mRNA表達(dá)水平比較 ENST00000484679-siRNA組ENST00000484679 mRNA表達(dá)水平低于siNC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

2.3 兩組肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ENST00000484679-siRNA組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于siNC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖4和表1。

表1 兩組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)）

2.4 兩組肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)水平比較 ENST00000484679-siRNA組N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平均低于siNC組，E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于siNC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖5和表2。

表2 兩組肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

lncRNA是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，參與多種腫瘤的生物學(xué)功能調(diào)控，比如增殖、凋亡、遷移、侵襲[5-7]。近年來，越來越多的研究表明lncRNA參與惡性腫瘤的化療藥物耐藥。Wang等[8]研究表明lncRNA GAS5通過降低PTEN表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和耐藥；Li等[9]研究表明lncRNA SNHG1通過激活A(yù)kt途徑促進(jìn)索拉菲尼耐藥。但是，目前對(duì)于lncRNA在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲的作用機(jī)制研究甚少，本研究篩選出調(diào)控肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞遷移、侵襲的關(guān)鍵lncRNA，為晚期索拉菲尼耐藥患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。本課題組通過對(duì)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞的lncRNA芯片微陣列分析，發(fā)現(xiàn)Huh7SR細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000484679高表達(dá)，熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證Huh7SR細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000484679高表達(dá)。通過加入lncRNA ENST00000484679-siRNA轉(zhuǎn)染，Huh7SR細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降，結(jié)合本課題組既往研究Huh7SR具有增強(qiáng)的遷移和侵襲能力，提示lncRNA ENST00000484679可能在調(diào)控肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的遷移、侵襲過程中扮演著重要角色。

EMT的特點(diǎn)是細(xì)胞間黏附的喪失以及遷移和侵襲特征的獲得。越來越多的研究表明，EMT在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞發(fā)生了EMT，同時(shí)具有增強(qiáng)的遷移和侵襲能力，證實(shí)了其相關(guān)性[13]，通過加入lncRNA ENST-00000484679-siRNA轉(zhuǎn)染，Huh7SR細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平上調(diào)，提示lncRNA ENST00000484679可能通過調(diào)控EMT影響肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，lncRNA ENST00000484679促進(jìn)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲能力可能與EMT有關(guān)，為研究晚期腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。