李青青 賈雅楠 丁懌虹 陸剛 唐建國 張學(xué)敏

膿毒癥是宿主對感染的一種失控反應(yīng)，常常導(dǎo)致嚴(yán)重的多器官功能障礙。膿毒癥是急診、ICU、老年科等科室急重癥患者主要死亡原因之一。膿毒癥治療現(xiàn)在多以抗生素為基礎(chǔ)，同時治療原發(fā)疾病，治療周期長、費用高，給患者造成很大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。膿毒癥患者晚期常存在免疫抑制或免疫麻痹，針對膿毒癥的免疫應(yīng)答機制研究及免疫反應(yīng)調(diào)控的藥物探尋具有重要意義[1]。免疫功能監(jiān)測指導(dǎo)下的免疫調(diào)節(jié)治療可能為改善膿毒癥預(yù)后開辟一種新的途徑。

人參為五加科多年生草本植物，人參皂甙Rg3是人參的有效成分，是從人參中提取的四環(huán)三萜類人參二型皂甙單體。人參皂甙Rg3本身是免疫增強劑，能增強人體對炎癥的抵抗作用[2]。本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激模擬膿毒癥狀態(tài)小鼠，觀察人參皂甙Rg3對膿毒癥狀態(tài)小鼠炎性因子水平、脾臟指數(shù)及淋巴細(xì)胞內(nèi)裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Cleaved Caspase-3）蛋白表達(dá)的影響，來探討人參皂甙Rg3對膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)的保護作用及淋巴細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 小鼠TNF-α試劑盒（批號：TNDE1021am）、IL-6試劑盒（批號：16NV1021m）、IL-1β ELISA試劑盒（批號：I1FE1021bm）均購自加拿大ANOGEN公司；LPS購自上海環(huán)碩生物科技有限公司；人參皂甙Rg3購自成都曼思特生物科技有限公司；Cleaved Caspase-3兔單克隆抗體（批號：3）購自美國Cell Signaling公司。酶標(biāo)儀（型號：318C+）購自上海市沛歐分析儀器有限公司；電熱恒溫水槽（DK-420）購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司電泳儀；轉(zhuǎn)膜儀（型號：DYCZ-40D）購自北京市六一儀器廠；熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：ChemiScope 6100）購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級BALB/c雄性小鼠40只，6～8周齡，體重18～23 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（滬）2014-0008。所有小鼠飼養(yǎng)在溫度和濕度受控的動物房中，具有12 h/12 h的光/暗循環(huán)，小鼠自由進食與飲水。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部動物福利和倫理小組批準(zhǔn)。

1.3 分組及模型制備 采用區(qū)組隨機法將小鼠分為對照組、人參皂甙Rg3組、LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組，每組10只。其中LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠通過腹腔注射LPS的方法制備膿毒癥模型。對照組用0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)7 d，第4天腹腔注射0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液；人參皂甙Rg3組將人參皂甙Rg3按30 mg/kg溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液后，灌胃，1次/d，連續(xù)7 d，第4天腹腔注射0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液；LPS組用0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)7 d，第4天腹腔注射0.3 ml LPS溶液（15 mg/kg LPS溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液）；人參皂甙Rg3+LPS組將人參皂甙Rg3按30 mg/kg溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液后，灌胃，1次/d，連續(xù)7 d，第4天腹腔注射0.3 ml LPS溶液（15 mg/kg LPS溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液）。

1.4 檢測指標(biāo)及方法 第7天所有小鼠用0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，剪開腹腔，通過腹主動脈采血，取血置于塑料離心管中，室溫離心分離出血清（3 000 r/min，10 min），取上層血清-70℃保存，用于測定炎性因子水平；然后采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟，計算脾臟指數(shù)；將脾臟剪成小塊，研磨過200目篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，采用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞置入凍存管-70℃保存，用于檢測蛋白表達(dá)。

1.4.1 血清炎性因子水平測定 取出血清后4℃復(fù)融，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.4.2 脾臟指數(shù)檢測 將小鼠的脾臟結(jié)締組織剪除，用濾紙吸凈表面的血液，用分析天平稱重，按以下公式計算出脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾重量（mg）/體重（g）×10。

1.4.3 Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取出淋巴細(xì)胞，解凍后用裂解液裂解，提取組織蛋白，應(yīng)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行蛋白質(zhì)分離，上樣后在12%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，以電轉(zhuǎn)膜方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入相關(guān)一抗孵育，4℃振蕩過夜，次日5%磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜，加入對應(yīng)二抗孵育，振蕩1 h，5%PBST洗膜，置于顯影儀中曝光顯影。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，用凝膠分析軟件Quantity One分析Cleaved Caspase-3蛋白條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠血清炎性因子水平比較 與對照組比較，LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高（均P＜0.05）；與LPS組比較，人參皂甙Rg3組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低（均P＜0.05），見表1。

表1 4組小鼠血清炎性因子水平比較（pg/ml）

2.2 4組小鼠脾臟指數(shù)比較 與對照組比較，LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠脾臟指數(shù)均升高（均P＜0.05）；與LPS組比較，人參皂甙Rg3組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠脾臟指數(shù)均降低（均P＜0.05），見表2。

表2 4組小鼠脾臟指數(shù)比較

2.3 4組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；與LPS組比較，人參皂甙Rg3組、人參皂甙Rg3+LPS組Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），見圖1、表3。

表3 4組小鼠淋巴細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase-3/β-actin蛋白灰度值比較

3 討論

膿毒癥的發(fā)病過程涉及到復(fù)雜的全身炎癥反應(yīng)、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷等多個方面，它可以由任何部位的感染引起。膿毒癥常常發(fā)生在原有慢性疾病或年老體衰、外科手術(shù)后等患者。LPS刺激是制作動物膿毒癥模型的一種常用方法，本研究采用LPS腹腔注射模擬膿毒癥狀態(tài)小鼠，小鼠均在刺激后逐漸出現(xiàn)豎毛、萎靡、腹瀉、飲食及活動次數(shù)減少，幾天后癥狀才逐漸緩解好轉(zhuǎn)。

機體發(fā)生膿毒癥時感染因素可激活機體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及其他炎癥反應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生并釋放大量炎性因子，膿毒癥期間TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平均會升高[3-5]，它們的協(xié)同作用被喻為是細(xì)胞因子誘發(fā)病理生理級聯(lián)反應(yīng)的扳機，抑制膿毒癥的炎癥，可以降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平[6]，通過檢測這些炎性因子的動態(tài)變化可以在一定程度上反映體內(nèi)炎癥的嚴(yán)重程度。本實驗中，小鼠腹腔注射LPS，刺激后3 d炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平和脾臟指數(shù)均高于對照組，而給予人參皂苷Rg3灌胃處理后小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平和脾臟指數(shù)均低于LPS組，提示人參皂甙Rg3能減少膿毒癥小鼠炎性因子分泌，降低炎癥反應(yīng)。

淋巴細(xì)胞凋亡是膿毒癥患者免疫抑制的主要原因，膿毒癥時機體大量淋巴細(xì)胞會發(fā)生凋亡，膿毒癥誘導(dǎo)的免疫抑制的主要特征包括T細(xì)胞功能障礙，其特征是脾臟T細(xì)胞凋亡，分化抗原4叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4 FoxP3 Tregs）升高，Th1免疫反應(yīng)抑制[7]，高水平的T淋巴細(xì)胞凋亡不僅導(dǎo)致大量免疫效應(yīng)細(xì)胞的丟失，而且會激活多種信號通路，導(dǎo)致機體內(nèi)免疫系統(tǒng)受到明顯抑制，因此減少T淋巴細(xì)胞的凋亡可以改善機體的免疫功能，提高膿毒癥患者的生存率[8]。既往研究表明脾臟中淋巴細(xì)胞凋亡狀況與炎癥的嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)[9]，28 d內(nèi)死亡的膿毒癥患者外周血淋巴細(xì)胞凋亡百分比明顯高于存活患者，死亡患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯低于存活患者[10]。

多種凋亡途徑最終激活凋亡執(zhí)行分子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3），Caspase-3在正常情況下以酶原的形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Caspase-3會被活化成為Cleaved Caspase-3，發(fā)揮促進細(xì)胞凋亡的作用[11]。Ibrahim等[12]通過實驗證明盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后的大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、NF-κB水平升高，凋亡介質(zhì)Caspase-3和p-JNK蛋白表達(dá)上調(diào)，通過非布索坦治療后，各測量參數(shù)均有明顯好轉(zhuǎn)，此外，還能改善組織病理變化，提高整體存活率。本實驗中，小鼠腹腔注射LPS，刺激后3 d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平高于對照組，而給予人參皂苷Rg3灌胃處理組小鼠的Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平低于LPS組，提示人參皂甙Rg3有減少小鼠膿毒癥時淋巴細(xì)胞凋亡的作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路調(diào)節(jié)線粒體自噬，改善線粒體功能障礙，保護膿毒癥引起的細(xì)胞和器官損傷[13]。人參皂苷Rg3能通過NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路發(fā)揮強抗炎效果，抑制一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶-2、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)[2]。

綜上所述，本實驗通過檢測人參皂苷Rg3對膿毒癥小鼠炎性因子及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響，提示人參皂苷Rg3具有降低膿毒癥小鼠炎性因子水平、脾臟指數(shù)及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活化水平的作用。本研究為動物實驗，存在一定的局限性和不足之處，為進一步探討其機制需進一步深入研究，同時在臨床上的有效性需要通過臨床試驗去驗證。