袁麗欣，劉泓江，王書晗，關又芳，臧德躍，林柏佑，王爾一

（深圳市醫(yī)療器械檢測中心，廣東 深圳 518000）

優(yōu)化精子是在人工授精過程中非常重要的一個環(huán)節(jié)，能有效提升男性精子活力和質量，提高受精成功率，降低畸形胚胎的形成，從而達到優(yōu)生優(yōu)育的目的[1，2]。而人工授精中使用的洗精液是《醫(yī)療器械分類目錄》中風險程度最高的第三類醫(yī)療器械[3，4]，本研究對該產品進行體外鼠胚試驗及囊胚細胞染色和計數良好囊胚數。常用的體外鼠胚試驗的基本指標是囊胚形成率，然而這一指標已不能完全符合輔助生殖技術質量的要求[5-7]。大量研究發(fā)現[8-10]，胚胎細胞數及囊胚細胞系分類計數是一種簡單實用的試驗方法，該方法是在原有的鼠胚試驗的基礎上增加了兩個檢測指標，分別為胚胎的細胞總數和囊胚期胚胎中內細胞團細胞和滋養(yǎng)層細胞的總數。本研究通過試驗對該洗精液進行評價，以期為該產品的發(fā)展及其在生物臨床應用中提供安全可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 洗精液：主要由氨基酸、葡萄糖、丙酮酸鹽、人血清白蛋白等組成。

1.2 試驗體系 6～8周齡B6D2F1雌鼠及性成熟B6D2F1雄鼠各10只，動物來源：北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK（京）2021-0006。動物管理：飼養(yǎng)：按照ISO 10993-2的規(guī)定進行；食物：使用由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的飼料；飲水：供給經滅菌的城市生活用水；環(huán)境：每日監(jiān)測室溫及環(huán)境濕度，將溫度范圍控制在20 ℃～26 ℃，相對濕度控制在40%～70%。

1.3 主要儀器 熒光倒置顯微鏡（Leica，型號：DMi8 automated）、體視顯微鏡（Leica，型號：S8APO）、蜂巢式CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，型號：FORMA STERI-CYCLE i250）、生物安全柜（Thermo，型號：MSC Advantage 1.8）、顯微鏡透明熱臺（Tokai Hit，型號：MAST-SZ2）。

1.4 主要試劑 孕馬血清促性腺激素（PMSG）（寧波第二激素廠，批號：2 1 0 7 2 7）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）（寧波第二激素廠，批號：210804）、M2操作液（Sigma，批號：SLCH1397）、Triton X-100（Sigma，批號：SLCF5969）、透明質酸酶（Sigma，批號：SLBS2130V）、礦物油（Sigma，批號：MKCM5905）、PBS緩沖液（Gibco，批號：2412439）、PI染色液（Sigma，批號：WXBD3718V）、Anti-UTF1（一抗）（Abcam，批號：GR3212508-2）、AF488（二抗）（全式金，批號：P20610）、30%山羊血清（Scientific Phygene，批號：20211203）、多聚甲醛（PFA）（Biosharp，批號：71050405）、牛血清白蛋白（Sigma，批號：WXBD4426V）。

1.5 試驗方法

1.5.1 體外鼠胚試驗 超數排卵：選擇6～8周齡B6D2F1雌鼠，經腹腔注射PMSG 10 IU/只；48 h后經腹腔注射 hCG 10 IU/只，注射hCG當天雌鼠與同品系雄鼠合籠過夜。準備培養(yǎng)皿：取胚前1 d下午，在35 mm培養(yǎng)皿中用KSOM培養(yǎng)液制做數滴30 μl的培養(yǎng)微滴，表面覆蓋培養(yǎng)油，按需制備，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱過夜平衡，時間約16 h。鼠胚采集：于合籠第2天早上檢查小鼠交配情況，選擇見栓小鼠備用。1-細胞胚胎收集：注射hCG 18 h后處死見栓雌鼠，將輸卵管壺腹部劃破，將收集到的絮狀受精卵團放置到提前預熱至37 ℃的透明質酸酶液滴中，當胚胎周圍的卵丘和顆粒細胞被消化分離后，立即轉移到M2操作液中清洗，挑選出形態(tài)正常的胚胎，轉移到培養(yǎng)微滴中，用于1-細胞鼠胚檢測試驗。體外培養(yǎng)：采用微滴法培養(yǎng)，將鼠胚隨機分為樣品組、陰性對照組和陽性對照組，每組不少于50枚。陰性對照組胚胎在培養(yǎng)液滴中清洗2～3次后，直接轉移到提前平衡好的微滴中培養(yǎng)。陽性對照組胚胎在培養(yǎng)液滴中清洗2～3次后，轉移到提前平衡好的陽性對照液滴中（含0.005% Triton X-100的KSOM）。樣品組胚胎在樣品液滴中清洗2～3次后，轉移到提前預熱至37 ℃的樣品液滴接觸20 min，接觸后的胚胎在培養(yǎng)液滴中清洗2～3次，轉移到提前平衡好的培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：每組鼠胚采集自3～5只小鼠，每個微滴中培養(yǎng)胚胎數不超過20枚。在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，檢查囊胚發(fā)育情況并計算囊胚形成率。囊胚形成率=囊胚數/（1-細胞胚胎數）×100%。可接受準則：陰性對照組囊胚形成率應≥80%；陽性對照組囊胚形成率應低于陰性對照組[11]。

1.5.2 囊胚染色和計數 囊胚收集：收集體外鼠胚試驗中樣品組和陰性對照組所有發(fā)育良好的囊胚備用。囊胚染色：于室溫下，用PBS對囊胚進行3次漂洗，10 min/次，漂洗完將囊胚放入2%的PFA中固定30 min；室溫下將囊胚轉移至透膜液中30 min，用PBS對囊胚進行3次漂洗，10 min/次；將囊胚置于30%的山羊血清中3 h，以封閉非特異性的抗體結合位點；PBS漂洗囊胚1次；4 ℃下與一抗結合12 h；PBS漂洗囊胚3次，10 min/次；室溫、避光條件下與二抗結合1 h；PBS漂洗囊胚3次，10 min/次；將胚胎移至PI染色液中，置于室溫避光條件下30 min；用PBS在玻片上做一個含囊胚的小液滴，在蓋玻片4個角分別滴一小滴甘油滴，用蓋玻片輕輕覆蓋囊胚樣品，輕壓蓋玻片使囊胚細胞延展平鋪；置于室溫避光條件下20 min；在熒光顯微鏡下直接計數。囊胚細胞染色和計數為熒光顯微鏡下計數囊胚細胞總數和內細胞團細胞數?？偧毎麛怠?0個，內細胞團細胞數≥12個為良好囊胚數[12]。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體外鼠胚試驗結果 陰性對照組囊胚形成率97.00%，陽性對照組囊胚形成率為0，試驗條件成立，樣品組的囊胚形成率為99.05%，見表1。

表1 各組體外鼠胚試驗結果（n，%）

2.2 囊胚染色和計數結果 每組計數32個囊胚，陰性對照組良好囊胚數占比為96.88%（31/32），樣品組良好囊胚數占比為93.75%（30/32），組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.350，P＞0.05），見表2、表3。

表2 陰性對照組囊胚細胞總數和內細胞團細胞總數（n）

表3 樣品組囊胚細胞總數和內細胞團細胞總數（n）

3 討論

人類輔助生殖技術起源于20世紀70年代，是目前公認治療不孕癥的最有效方法[13]。近年來，在社會需求的刺激下，人類輔助生殖技術和產業(yè)迅速發(fā)展并不斷完善，輔助生殖技術用醫(yī)療器械產品也愈加豐富[14，15]。而這類醫(yī)療器械的安全性和有效性直接影響著患者以及子代的安全與健康，因此要對其質量和安全性給予高度重視并嚴格監(jiān)管，其中的生物相容性評價也是監(jiān)管重點，主要的評價項目除了要包含GB/T 16886系列中涉及的如致敏、急性全身毒性等常規(guī)檢驗項目之外，對于可能接觸配子和/或胚胎的產品，需要進行體外鼠胚試驗，體外鼠胚試驗分為1-細胞和2-細胞兩種方法，由于1-細胞胚胎方法更為敏感，因此標準推薦使用1-細胞胚胎法[16，17]。鼠胚試驗結果是觀察囊胚發(fā)育情況并計算囊胚形成率，但是僅憑這兩點無法完整地說明囊胚質量的優(yōu)劣。因此，可兼用囊胚染色和計數法，通過對囊胚細胞染色和計數良好囊胚數對發(fā)育期的胚胎進行分析[18]。

本研究結果顯示，陰性對照組囊胚形成率97.00%，陽性對照組囊胚形成率為0，試驗條件成立，樣品組的囊胚形成率為99.05%；陰性對照組良好囊胚數占比為96.88%（31/32），樣品組良好囊胚數占比為93.75%（30/32），組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由此可見，我國輔助生殖技術用醫(yī)療器械和國內產業(yè)已初具雛形，標準化工作和監(jiān)督技術也日益完善，這些都將成為輔助生殖用醫(yī)療器械后續(xù)發(fā)展的重要動力和保障，也為該類產品檢測及監(jiān)管提供技術參考。

綜上所述，該種洗精液體外鼠胚試驗囊胚形成率及囊胚細胞染色和計數符合標準要求，可進一步用于臨床研究。