袁華根，安 東，徐亞亞，高 峰*

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

腸道是動物體消化吸收的主要場所。腸道發(fā)育形態(tài)、消化酶活性及完整性可反映動物的生長及健康狀況（Schenck等，2001）。日糧中含有的營養(yǎng)物質(zhì)在吸收的同時也在改變腸道的生長發(fā)育，并影響其生理功能（孫德文等，2003）。谷氨酰胺能促進(jìn)肉雞腸道發(fā)育，同時也是機(jī)體免疫細(xì)胞的主要能源之一（王書平等，2009）。而α-酮戊二酸（AKG）作為谷氨酰胺的前體物質(zhì)在維持腸道屏障完整和為腸道供能等方面與谷氨酰胺作用相同。目前，大多數(shù)相關(guān)研究都采用化學(xué)合成的AKG作為添加劑，而微生物發(fā)酵的AKG具有成本低、使用安全等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣泛。本試驗以AA肉雞為試驗對象，研究日糧添加AKG制劑對肉雞腸道形態(tài)、空腸抗氧化性能、血漿DAO含量、空腸sIgA含量及生產(chǎn)性能的影響，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的AKG應(yīng)用于畜禽飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料1日齡AA肉雞雛雞，α-酮戊二酸制劑（有效含量293 g/kg）。

1.2 試驗設(shè)計試驗采取單因素試驗設(shè)計，將192只體重?zé)o顯著差異的健康1日齡AA肉仔雞隨機(jī)分為4組，其中對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，處理組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.2%、0.4%、0.8%的AKG制劑，每個處理6個重復(fù)，每重復(fù)8只雞，試驗為期42 d。肉雞雙層籠養(yǎng)，自由采食和飲水，自然光照加白熾燈補(bǔ)光，常規(guī)免疫程序免疫。

1.3 樣品采集于21和42 d，在每個重復(fù)中隨機(jī)挑選2只體重接近的肉雞進(jìn)行屠宰采樣。用10 mL離心管采集頸動脈血液，4℃，3000 r/min離心10 min，取上清液分裝于-20℃冰箱中保存。在碎冰上分離肉雞十二指腸、空腸和回腸等組織，采集十二指腸U形彎曲上端，回腸和空腸中端腸段各1 cm，用預(yù)冷的0.75%生理鹽水清洗后迅速放入4%的多聚甲醛磷酸緩沖液（pH為7.4）中固定，用石蠟切片，HE染色。除去空腸內(nèi)容物，剪開腸段并用預(yù)冷的0.75%生理鹽水清洗，用消毒滅菌過的載玻片分別刮取空腸黏膜于凍存管中，液氮保存待測。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 小腸常規(guī)HE染色和觀察測定 將固定于4%多聚甲醛溶液中24 h左右的小腸各段組織制作石蠟切片，常規(guī)HE染色，鏡檢合格后封片。用顯微鏡照相系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照，其中對第21和42天肉雞腸道形態(tài)圖片進(jìn)行4×10倍放大，每張切片隨機(jī)選取絨毛結(jié)構(gòu)清晰且走向平直完整的10個不同視野；用Image-Pro Plus 6.0軟件測量每個圖片視野中選定的3條絨毛的絨毛高度（VH）及其相連的隱窩深度（CD），并計算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/CD）。最后，對每只雞每個腸段切片樣品10個視野測量值的平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析，每個處理為6只雞。

1.4.2 空腸黏膜抗氧化能力指標(biāo)測定 準(zhǔn)確稱取空腸黏膜樣品0.3 g，將其置于10 mL離心管中，向離心管中加入2.7 mL預(yù)冷的0.75%生理鹽水，邊冰浴邊用勻漿機(jī)2500 r/min進(jìn)行勻漿。高速冷凍離心機(jī)離心10 min（3000 r/min），取上清液得到10%組織勻漿液，-20℃分裝保存待測。采用試劑盒分別測定總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）及丙二醛（MDA），測定方法嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。樣品蛋白含量使用考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)行測定。

1.4.3 血漿DAO含量測定 血漿中二胺氧化酶（DAO）含量采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測。

1.4.4 空腸黏膜sIgA含量測定 空腸黏膜中分泌型免疫蛋白A（sIgA）含量采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測。

1.4.5 生長性能測定 按重復(fù)分別在21和42 d早晨飼喂前空腹稱重、結(jié)料，并計算平均日增重（ADG）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行初步數(shù)據(jù)整理，SPASS 22.0進(jìn)行單因子方差分析，采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加AKG制劑對肉雞小腸黏膜形態(tài)的影響由表1可知，21 d，0.4% AKG組十二指腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）；0.4%、0.8% AKG組十二指腸絨毛高度和隱窩深度的比值顯著高于對照組（P＜0.05）；十二指腸隱窩深度隨AKG制劑添加濃度的遞增呈現(xiàn)下降趨勢（P＜0.10）；0.4%、0.8% AKG組空腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）；0.4%、0.8% AKG組空腸絨毛高度和隱窩深度的比值顯著高于對照組（P＜0.05）；0.2%、0.4%與0.8%AKG組回腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）；0.2%、0.4%與0.8% AKG組回腸隱窩深度顯著高于對照組（P＜0.05）；42 d，0.2%、0.4% AKG組回腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）；0.2% AKG組回腸隱窩深度顯著高于對照組（P＜0.05）；其他結(jié)果差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 AKG制劑對肉雞小腸黏膜形態(tài)的影響

2.2 日糧添加AKG制劑對肉雞空腸黏膜抗氧化能力的影響由表2可知，21 d，0.4% AKG、0.8% AKG組空腸GSH-Px活性顯著高于對照組（P＜0.05）；0.4% AKG、0.8% AKG組空腸MDA含 量 顯 著 低 于 對 照 組（P＜0.05）；42 d，0.2% AKG、0.8% AKG組空腸GSH-Px活性顯著高于對照組（P＜0.05）；空腸MDA含量隨著AKG制劑濃度的提高呈下降趨勢（P＜0.10）；其他結(jié)果差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 AKG制劑對肉雞空腸抗氧化能力的影響

2.3 日糧添加AKG制劑對肉雞血漿DAO含量 的 影 響由 表3可 知，21 d，0.2%、0.4%與0.8% AKG組血漿DAO含量顯著低于對照組（P＜0.05）；42 d，0.4%、0.8% AKG組血漿DAO含量顯著低于對照組（P＜0.05）。

表3 AKG制劑對肉雞血漿DAO含量的影響 pg/L

2.4 日糧添加AKG制劑對肉雞空腸黏膜sIgA含量的影響由表4可知，42 d，0.4%、0.8% AKG組空腸sIgA含量顯著高于對照組（P＜0.05）；其他結(jié)果差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 AKG制劑對肉雞空腸sIgA含量的影響 pg/mg

2.5 日糧添加AKG制劑對肉雞生長性能的影響由 表5可 知，1～21 d，0.2% AKG、0.4% AKG、0.8%AKG組平均日增重均顯著高于對照組（P＜0.05）。

表5 AKG制劑對肉雞生長性能的影響 g

3 討論

3.1 日糧添加AKG制劑對肉雞小腸黏膜形態(tài)的影響腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)是促進(jìn)動物腸道健康及其生長性能的前提（師昆景等，2009）。小腸絨毛高度越高，隱窩深度越低，就越利于腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。而隱窩深度的增加則代表小腸上皮細(xì)胞的減少，因此，絨毛高度與隱窩深度的比值可在一定程度上反映小腸上皮細(xì)胞的代謝程度（Hampson，1986）。本試驗在肉雞日糧中添加AKG制劑，21 d時顯著提高了小腸各腸段的絨毛高度，42 d時可顯著提高空腸與回腸的絨毛高度。結(jié)果證明，AKG可改善并促進(jìn)小腸早期發(fā)育和營養(yǎng)吸收功能。但值得注意的是，在十二指腸與空腸隱窩深度降低的同時，回腸隱窩深度顯著升高，其原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 日糧添加AKG制劑對肉雞空腸抗氧化能力的影響AKG抗氧化功能有3種：一是直接與H2O2反應(yīng)分解過氧化物；二是有利于肉毒堿生成，促進(jìn)脂肪正常代謝，減少自由基生成；三是參與機(jī)體GSH的合成，提高GSH的含量（Stoyanova，2011）。通常適量的自由基對機(jī)體有益，如果自由基產(chǎn)生過量會破壞機(jī)體正常秩序及生理代謝，嚴(yán)重時甚至?xí)l(fā)疾病。生物體細(xì)胞內(nèi)存在SOD、GSH-Px等自由基清除系統(tǒng)，MDA是氧自由基攻擊生物膜形成的脂質(zhì)過氧化物之一，隨著體內(nèi)氧自由基活性增強(qiáng)，含量升高，則抗氧化作用減弱，因此，MDA高低可反映機(jī)體過氧化的程度（張克烽等，2007）。而總抗氧化能力（T-AOC）則反映非酶類和酶類抗氧化物清除自由基的總體能力。黃冠慶等（2006）報道，在黃羽肉雞日糧中添加谷氨酰胺可顯著提高血液GSHPx活性，顯著降低血液MDA含量。其原因主要為谷氨酰胺是谷胱甘肽的前體物質(zhì)，外源添加谷氨酰胺可提高谷胱甘肽的水平，促使GSH-Px的活性升高，從而加強(qiáng)了清除自由基的能力（黃冠慶和林紅英，2006）。在本試驗中，日糧添加AKG制劑可顯著提高空腸中GSH-Px的活性，顯著降低21 d肉雞空腸MDA的含量，對42 d肉雞空腸MDA含量也有降低趨勢。

3.3 日糧添加AKG制劑對肉雞血漿DAO含量的影響二胺氧化酶（DAO）是小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在組胺和多種多胺代謝中起作用，當(dāng)小腸黏膜上皮細(xì)胞受損后，DAO釋放入血，使血液內(nèi)DAO水平升高（鄧鏡龍等，2017）。因此，血液中DAO含量的變化可準(zhǔn)確反映腸道的損傷程度及完整性。在本試驗中，日糧添加AKG制劑可顯著降低血漿內(nèi)DAO含量。說明AKG可以為腸上皮細(xì)胞補(bǔ)充氮源，為腸道細(xì)胞代謝提供能量，保障腸道屏障功能的完整性和正常的吸收功能。

3.4 日糧添加AKG制劑對肉雞空腸sIgA含量的影響AKG在免疫代謝方面也具有重要作用。研究表明，外源攝入的膳食AKG能增加腸道免疫球蛋白A的分泌，增加小腸上皮淋巴結(jié)的面積，同時AKG可以提高畜禽的體液免疫、細(xì)胞免疫及非特異性免疫能力（王蕾，2010）。AKG的產(chǎn)物谷氨酰胺可作為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的主要能量來源。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是由消化道黏膜上的B淋巴細(xì)胞分泌出的抗體蛋白，主要存在于黏膜表面，通過免疫排斥作用阻止病原體入侵細(xì)胞，為機(jī)體提高免疫力。本試驗中，日糧添加AKG制劑能顯著提高42 d肉雞空腸sIgA含量，有效提高肉雞腸道黏膜免疫力，有利于促進(jìn)肉雞腸道健康。