劉 瑩，遲 惠，劉 艷，于 妍*

（1.長(zhǎng)春科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130600；2.吉林省藥品檢驗(yàn)研究院，吉林長(zhǎng)春 130000）

鋅是動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素，是動(dòng)物體內(nèi)多種酶的重要部分，與動(dòng)物體內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和核酸代謝密切相關(guān)（袁心田等，2022）。種禽如果缺鋅，將對(duì)種蛋孵化和雞雛發(fā)育等造成嚴(yán)重影響。此外，鋅元素是睪丸發(fā)育和精子形成過(guò)程中所必需的微量元素，種公禽缺鋅將會(huì)導(dǎo)致其睪丸發(fā)育不良和精子形成障礙（高慶江和郝金法，2003）。而缺乏鋅元素也會(huì)導(dǎo)致幼齡動(dòng)物生長(zhǎng)遲緩、發(fā)育不良、關(guān)節(jié)腫大及免疫功能下降（王金和，2017）。目前，在動(dòng)物生產(chǎn)中多以無(wú)機(jī)鋅的方式添加鋅元素。無(wú)機(jī)鋅不僅生物利用率低，攝入過(guò)量還會(huì)導(dǎo)致中毒。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)機(jī)鋅相比，有機(jī)鋅不僅具有更高的生物利用率，還更安全（Yonekura和Suzuki，2003）。而鋅多糖作為第三代補(bǔ)鋅劑，能被人體更高效、更安全的利用，已成為目前的研究熱點(diǎn)（趙姝雯等，2016；陳宏偉等，2009）。現(xiàn)如今，鋅多糖的合成主要有化學(xué)合成法、微生物轉(zhuǎn)化法和植物轉(zhuǎn)化法（陳平等，2015）。

黃芪，最先記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有2000多年的用藥歷史。目前為止，已從黃芪中分離鑒定出多種生物活性大分子，包括皂苷、氨基酸、異黃酮和多糖等。黃芪多糖是黃芪中的重要大分子活性物質(zhì)，主要分為雜多糖和葡聚糖。大量研究表明，黃芪多糖具有多種生物學(xué)功能，如抗氧化、抗炎、和免疫調(diào)節(jié)等（Yu等，2022；Auyeung等，2016），可提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和機(jī)體抗氧化能力。趙正偉等（2022）研究表明，在日糧中添加黃芪多糖可顯著提高灘羊生長(zhǎng)性能和血清抗氧化能力。黃芪多糖可降低仔豬腹瀉率，提高仔豬生長(zhǎng)性能、免疫功能和血清抗氧化功能（崔玉革和李玉青，2022）。當(dāng)前，一系列研究表明，與多糖相比，鋅多糖在抗氧化、抗炎、降血脂、抗腫瘤等功能上效果更好。江潔等（2018）研究表明，羊肚菌菌絲體鋅多糖比羊肚菌菌絲體多糖具有更好的抗氧化活性。羅敏等（2017）以大米胚芽多糖和硫酸鋅為原料制備大米胚芽鋅多糖，結(jié)果表明，與大米胚芽多糖相比，大米胚芽鋅多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率更高，其抗氧化活性更強(qiáng)。目前，對(duì)黃芪鋅多糖體內(nèi)、體外抗氧化活性的研究尚未報(bào)道。因此，本試驗(yàn)用黃芪多糖與硫酸鋅制備出黃芪鋅多糖，并研究其體外抗氧化活性，旨在為開(kāi)發(fā)具有不同新型多糖與鋅元素螯合物的研究奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)增加黃芪多糖的附加值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器試驗(yàn)選取3周齡雄性昆明種健康小鼠，體重（10～12）g，購(gòu)于吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；黃芪飲片購(gòu)買(mǎi)于吉林百草大藥房；石油醚、苯酚、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、DPPH、VC等均為分析純：北京化工廠。

Z-2000火焰原子吸收光譜儀：日本日立公司；BLHH-6N數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：上海森信儀器有限公司；Uvmini-1240紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；TS-2脫色搖床：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；SHA-B水浴恒溫水浴鍋器：常州市儀都儀器有限公司；TG-21WC高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃芪多糖的提取 黃芪多糖采用水提醇沉法進(jìn)行提取，具體步驟：將1 kg黃芪飲片粉碎過(guò)60目篩，隨后加入10倍體積石油醚脫脂4 h。將脫脂后的濾渣烘干，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水70℃提取2 h，提取3次；收集濾液，蒸發(fā)濃縮后加入3倍體積無(wú)水乙醇，4℃靜置后產(chǎn)生沉淀。5000 r/min離心15 min。將沉淀物復(fù)溶后加入sevag試劑（正丁醇∶氯仿=1∶3）進(jìn)行脫蛋白處理，反復(fù)多次，直至無(wú)明顯殘留。置50℃烘箱干燥即得黃芪粗多糖（APSd）。將黃芪粗多糖溶液緩慢滴加到經(jīng)處理過(guò)的加樣至DEAE-52纖 維 素 柱，用 蒸 餾 水、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為5 mL/min，5 mL收集一管，蒽酮-硫酸法檢測(cè)至無(wú)糖檢出，合并主要吸收峰的洗脫液，氯化鈉洗脫部分透析48 h除鹽，濃縮冷凍干燥，得到純化的黃芪多糖（APSp）。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定黃芪多糖中多糖含量，具體步驟參考羅敏等（2017）的方法進(jìn)行。

1.2.3 黃芪鋅多糖的制備 取1.0 g黃芪多糖溶于150 mL蒸餾水中配制成黃芪多糖溶液，隨后緩慢加入0.8 g ZnSO4·7H2O 溶液，調(diào)節(jié)溶液pH至6.0，50℃水浴攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)完畢后，70℃濃縮至原體積的1/3，隨后冷卻，加入4倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀，4℃靜置24 h，4000 r/min，離心15 min得到沉淀，將沉淀用少量去離子水溶解后用蒸餾水透析24 h，乙醇醇析沉淀物，50℃真空干燥得黃芪鋅多糖（鋅APSp）。

1.2.4 鋅多糖中鋅含量的測(cè)定 使用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鋅元素含量，具體步驟參考王艷等（2013）的方法進(jìn)行。

1.2.5 體外抗氧化性試驗(yàn) 試驗(yàn)分別測(cè)定黃芪鋅多糖·OH、O2-·和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由清除率，以VC為對(duì)照，具體試驗(yàn)步驟參考黃玲玲等（2015）的方法進(jìn)行。

1.2.6 體內(nèi)抗氧化性試驗(yàn)

1.2.6.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及樣品采集 將40只4周齡健康昆明雄性小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只?？瞻捉M：上午腹腔注射生理鹽水15 mL/（kg·d），下午灌胃生理鹽水10 mL /（kg·d）；對(duì)照組：上午腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d），下午灌胃生理鹽水10 mL/（kg·d）；黃芪多糖組：上午腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d），下午灌胃黃芪多糖200 mg/（kg·d）；黃芪鋅多糖組：上午腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d），下午灌胃黃芪鋅多糖200 mg/（kg·d），連續(xù)試驗(yàn)30 d。小鼠喂養(yǎng)條件：溫度為20～24℃，相對(duì)濕度為55%～65%，循環(huán)光照12 h。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠處死前12 h禁食不禁水。各組小鼠按2.0 g/kg體重注射氨基甲酸乙酯進(jìn)行麻醉，眶靜脈竇取血至抗凝管中；抗凝管中的血液樣品（4℃，3000 r/min，15 min），取血漿于-20℃保存。隨后斷頸處死小鼠，收集小鼠肝臟組織用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6.2 小鼠血清及肝臟抗氧化能力的測(cè)定 使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定小鼠血清及肝臟中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活 性、總 抗 氧 化 能 力（Total antioxidant capability，T-AOC）、過(guò)氧化脂質(zhì)（Lipid peroxide，LPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，具體試驗(yàn)步驟參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。使用GraphPad Prism軟件制圖，當(dāng)P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖得率和糖含量由表1可知，去蛋白后的黃芪粗多糖（APSd）得率為（4.12±0.15）%，多糖含量為（56.15±2.38）%；經(jīng)DEAE-52纖維素柱純化后的黃芪多糖（APSp）得 率 為（2.01±0.13）%，多 糖 含 量 為（83.17±1.95）%。

表1 黃芪多糖的得率和糖含量 %

2.2 黃芪鋅多糖的得率、糖含量和鋅含量本試驗(yàn)制備黃芪鋅多糖的條件是先前實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的最適條件。由表2可知，鋅化黃芪多糖 得率 為（34.46±2.05）%，其中 多 糖含 量 為（56.35±4.87）%，鋅含量為（11.32±0.48）mg/g。

表2 黃芪鋅多糖的得率、糖含量和鋅含量

2.3 黃芪鋅多糖體外抗氧化作用

2.3.1 黃芪鋅多糖·OH清除率結(jié)果分析 由圖1可知，隨著APSp和鋅APSp濃度的增加，對(duì)·OH自由基的清除率逐漸增加，表現(xiàn)出量效關(guān)系。當(dāng)濃 度為2.0 mg/mL時(shí)，APSp和 鋅APSp對(duì)·OH自由基的清除率分別為43.33%和50.47%，均低于VC，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.16和0.13 mg/mL。當(dāng) 濃 度 為0.7 mg/mL時(shí)，APSp和 鋅APSp二 者對(duì)·OH自由基的清除率趨于平緩。VC對(duì)·OH自由基的清除率達(dá)84.92%，可見(jiàn)APSp和鋅APSp二者的·OH清除率與VC差異較大。此外，結(jié)果表明，鋅APSp清除·OH的活性比APSp提高16.45%。

圖1 黃芪鋅多糖對(duì)·OH清除率

2.3.2 黃芪鋅多糖O2-·清除率結(jié)果分析 APSp和鋅APSp對(duì)O2-·均有一定的清除作用。其清除能力與多糖質(zhì)量濃度成正相關(guān)。當(dāng)多糖濃度為2.0 mg/mL時(shí)，APSp和鋅APSp對(duì)O2-·的清除率分別為37.91%和48.83%，二者IC50分別為0.17和0.19 mg/mL，均低于VC。當(dāng)VC濃度為2.0 mg/mL時(shí)，VC對(duì)O2-·的清除率為91.13%。對(duì)O2-·清除作用大小為VC＞鋅APSp＞APSp。此外，試驗(yàn)結(jié)果表明，鋅APSp清除O2-·的活性比APSp提高28.80%。

圖2 黃芪鋅多糖對(duì)O2-·清除率

2.3.3 黃芪鋅多糖DPPH自由基清除率結(jié)果分析 由 圖3可 知，APSp和 鋅APSp對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度增加逐漸增加。當(dāng)多糖濃度 為2.0 mg/mL時(shí)，APSp和 鋅APSp對(duì)DPPH自由基的清除率分別為56.36%和72.72%，二者IC50分別為0.16和0.13 mg/mL。當(dāng)多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí)，APSp和鋅APSp二者對(duì)DPPH自由基的清除率趨于平緩。對(duì)DPPH清除作用大小為VC＞鋅APSp＞APSp。此外，試驗(yàn)結(jié)果表明，鋅APSp清除DPPH的活性比APSp提高26.15%。

圖3 黃芪鋅多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

2.4 黃芪鋅多糖體內(nèi)抗氧化作用

2.4.1 黃芪鋅多糖對(duì)小鼠血清抗氧化功能的影響 由表3可知，APSp組和鋅APSp組小鼠血清中SOD、CAT和T-AOC活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），MDA和LPO水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。此外，APSp組和鋅APSp組小鼠血清中SOD、MDA、T-AOC和LPO水平具有顯著差異，鋅APSp組小鼠血清中SOD和T-AOC活性顯著高于APSp組（P＜0.05），MDA和LPO水平顯著低于APSp組（P＜0.05）。

表3 黃芪鋅多糖對(duì)小鼠血清抗氧化功能的影響

2.4.2 黃芪鋅多糖對(duì)小鼠肝臟抗氧化功能的影響 由表4可知，APSp組和鋅APSp組小鼠肝臟中SOD、CAT和T-AOC活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），MDA和LPO水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。此外，與APSp組相比，鋅APSp組小鼠肝臟中SOD、CAT和T-AOC活性顯著升 高（P＜0.05），MDA和LPO水 平 顯 著 降 低（P＜0.05）。

表4 黃芪鋅多糖對(duì)小鼠肝臟抗氧化功能的影響

3 討論

黃芪多糖因其良好的抗氧化活性，提高機(jī)體免疫力和抗腫瘤等功能已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。此外，鋅作為體內(nèi)重要的微量元素，在體內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝調(diào)控等生理過(guò)程中起重要作用（黃玲玲等，2015）。通過(guò)化學(xué)合成的方式將黃芪多糖與無(wú)機(jī)鋅合成黃芪鋅多糖不僅可以提高黃芪多糖的抗氧化活性等功能，還可提高機(jī)體對(duì)無(wú)機(jī)鋅的利用。在本試驗(yàn)中，按照實(shí)驗(yàn)室先前的優(yōu)化條件利用黃芪多糖和硫酸鋅制備出黃芪鋅多糖，通過(guò)測(cè)定得出所獲得的黃芪鋅多糖鋅元素含量為11.32 mg/g，多糖含量為56.35%。

體外自由基清除能力是評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)活性 的 重 要 指 標(biāo)（Duan等，2021；Samavati等，2013）。本研究運(yùn)用體外抗氧化試驗(yàn)對(duì)黃芪鋅多糖的·OH、O2-·和DPPH自由基清除能力進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，與黃芪多糖相比，黃芪鋅多糖具有更強(qiáng)的體外抗氧化能力，其對(duì)·OH、·和DPPH自由基清除能率更高。研究表明，通過(guò)將多糖與鋅進(jìn)行螯合獲得鋅多糖后，其鋅多糖的基本骨架沒(méi)有改變，只有部分羥基和羰基發(fā)生改變，鋅多糖維持了多糖的活性結(jié)構(gòu)（Dong等，2018）。先前的研究表明，鋅多糖相比于多糖具有更高的抗氧化活性。與羅爾阿太菌相比，羅耳阿太菌鋅多糖的體內(nèi)外抗氧化活性更高（董金滿(mǎn)，2018）。羅敏等（2013）研究證實(shí)，大米胚芽多糖鋅化后，其對(duì)·OH、O2-·和DPPH自由基的清除能力更強(qiáng)。Zheng等（2020）研究結(jié)果也表明，光帽鱗傘菌絲體鋅多糖的體外抗氧化能力較光帽鱗傘菌絲體多糖更高。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，通過(guò)對(duì)多糖進(jìn)行鋅化后，其體外抗氧化能力會(huì)得到提高。

抗氧化指標(biāo)與動(dòng)物機(jī)體健康程度、體內(nèi)代謝、外界環(huán)境變化及機(jī)體免疫能力密切相關(guān)。SOD和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激酶，是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激指標(biāo)。T-AOC水平反映了機(jī)體抵抗自由基傷害的非酶促防御能力（Jin等，2012）。此外，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物L(fēng)PO具有一定的毒性，可以影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞代謝，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。因此，LPO的含量作為組織損傷的一項(xiàng)指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于抗氧化研究。而MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物，會(huì)引起體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，可反映細(xì)胞受損傷程度及脂質(zhì)過(guò)氧化程度（計(jì)莉強(qiáng)等，2017）。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激影響時(shí)，其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基水平升高，體內(nèi)SOD、CAT和T-AOC水平顯著降低，MDA和LPO水平顯著升高。在本試驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠受到D-半乳糖的刺激，導(dǎo)致體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，其血清和肝臟中SOD、CAT和T-AOC水平顯著降低，而LPO和MDA水平顯著升高，這與先前的研究結(jié)果一致。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖和黃芪鋅多糖具有很好的抗氧化功能，可有效清除·OH、O2-·和DPPH自由基。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，黃芪多糖組和黃芪鋅多糖組小鼠血清和肝臟中SOD、CAT和T-AOC水 平 顯 著 升 高，而LPO和MDA水平顯著降低，表明黃芪多糖和黃芪鋅多糖同樣具有很強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化能力，可緩解小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究也表明，鋅多糖同樣具有很強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化功能。Xie等（2021）研究表明，滸苔鋅多糖可顯著提高仔豬血清中GSH-Px、T-AOC和CAT水平。陳麗等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，紅汁乳菇鋅多糖顯著提高了2型糖尿病小鼠血清中SOD、CAT水平，顯著降低了MDA水平。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)以黃芪多糖和硫酸鋅為原料制備的黃芪鋅多糖具有很好的抗氧化活性。清除·OH、O2-·和DPPH自由基的試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，而通過(guò)合成法制備的黃芪鋅多糖比黃芪多糖具有更強(qiáng)的體外抗氧化活性；此外，體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖和黃芪鋅多糖顯著提高了D-半乳糖致衰老小鼠血清和肝臟中SOD、CAT和T-ACO活性，降低了MDA和LPO水平，且黃芪鋅多糖比黃芪多糖具有更強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性。