王會文， 范軍強(qiáng)， 路曉明， 曾 瑞， 武軍艷， 劉麗君， 馬 驪， 蒲媛媛， 孫萬倉， 李學(xué)才

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室，甘肅蘭州730070)

關(guān)鍵字： 白菜型冬油菜；NAC轉(zhuǎn)錄因子；家族分析；非生物脅迫；表達(dá)分析

氣候變化是當(dāng)今人類面臨的重大風(fēng)險挑戰(zhàn)，荒漠化不僅威脅著全球生態(tài)環(huán)境，而且對各個國家和地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生重大影響。中國北方大多數(shù)地區(qū)為干旱半干旱氣候，冬季寒冷干燥，這種氣候和人類活動的影響更容易使土地荒漠化[1]，21世紀(jì)以來，全球土地荒漠化現(xiàn)象正在日益加劇，在中國北方地區(qū)尤其明顯。隴油系列白菜型冬油菜可以在寒冷干旱的惡劣環(huán)境中正常越冬[2]，擁有豐富的抗逆基因，使油菜的分布范圍更加廣泛，可以在北緯48°的阿勒泰等地區(qū)種植[3]。與此同時，白菜型冬油菜增加了中國北方地區(qū)的復(fù)種指數(shù)，提高了當(dāng)?shù)赝恋乩寐屎图Z油產(chǎn)量[4]，使油菜不僅可以作為傳統(tǒng)的油料作物，還可以作為冬季覆蓋作物。在北方干旱寒冷區(qū)域大面積種植冬油菜可以增加土壤覆蓋率，同時有效防止土地沙漠化，減少沙塵天氣[5]，對改善生態(tài)環(huán)境具有重要作用。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展和對白菜型冬油菜基因組測序的完成，挖掘白菜型冬油菜中儲存的基因信息，以闡明植物生長發(fā)育機(jī)制、各種逆境脅迫機(jī)理，并利用其豐富的抗逆基因增強(qiáng)作物抵御環(huán)境脅迫的能力，為今后培育適應(yīng)性更強(qiáng)的品種提供理論依據(jù)。

植物在長期適應(yīng)外界多變的環(huán)境過程中，自身形成了響應(yīng)逆境脅迫的防御體系，其本質(zhì)就是通過內(nèi)部的基因表達(dá)，使植物在復(fù)雜的環(huán)境中調(diào)節(jié)體內(nèi)生化代謝途徑和生長發(fā)育進(jìn)程來適應(yīng)外界環(huán)境變化[6]。轉(zhuǎn)錄因子作為蛋白質(zhì)，可以與目的基因啟動子或增強(qiáng)子的區(qū)域相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)[7]，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)是植物特有的最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，NAC蛋白結(jié)構(gòu)由高度保守的N端和可變的C端(TR)組成，N端分為A、B、C、D、E 5個亞結(jié)構(gòu)域[8]，不同亞結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著不同的作用。其中，C、D高度保守，負(fù)責(zé)與目標(biāo)靶基因的DNA序列識別并結(jié)合，B、E則保守性較弱，和C端功能相似，一起促成其功能的多樣性；亞結(jié)構(gòu)域A可以形成二聚體，和DNA結(jié)合有關(guān)[9]。NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白通常與植物細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合在一起，當(dāng)植物受到外界不利環(huán)境信號刺激后，與NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合的受控蛋白被水解，然后NAC蛋白進(jìn)入細(xì)胞核[10]。NAC蛋白結(jié)構(gòu)域N端的亞結(jié)構(gòu)域可形成二聚體，與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，調(diào)控靶基因啟動子區(qū)基因的表達(dá)[9]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的這種調(diào)節(jié)方式可以使植物迅速對外界環(huán)境作出反應(yīng)，有利于為植物的生長發(fā)育創(chuàng)造良好的內(nèi)部環(huán)境。NAC家族成員廣泛分布在植物中，成員多達(dá)100個以上[11-13]。NAC蛋白結(jié)構(gòu)域C端具有高度可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，在不同的條件下具有不同的轉(zhuǎn)錄特性，從而激活或抑制不同的轉(zhuǎn)錄過程[14]，為其參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、器官衰老、果實成熟、各種非生物脅迫防御等提供條件[15]。

在番茄中，NAC轉(zhuǎn)錄因子基因SlNAM1與合成乙烯的2個關(guān)鍵基因SlACS2和SlACS4的啟動子結(jié)合并激活其表達(dá)[16]，促進(jìn)了乙烯的合成，而SlNAM1突變體則延遲番茄的成熟；PdeNAC是赤松纖維素合成酶合成的關(guān)鍵基因，促進(jìn)了赤松次生細(xì)胞壁的形成和管胞分化，增加了煙草和擬南芥次生細(xì)胞壁的沉積[17]；擬南芥轉(zhuǎn)錄因子基因NAC103在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中被上調(diào)[18]，其編碼蛋白質(zhì)對脫落酸敏感，并正向調(diào)節(jié)多個脫落酸(ABA)應(yīng)答下游基因，提高了擬南芥種子的發(fā)芽率。在調(diào)控植株衰老過程中，ANAC087和ANAC046具有協(xié)同作用，通過控制擬南芥根冠程序性死亡來促進(jìn)植株的衰亡，ANAC087通過核酸酶BFN1降解根部細(xì)胞的染色質(zhì)[19]，ANAC046通過內(nèi)含子順式作用元件和相關(guān)蛋白質(zhì)的修飾主動調(diào)控細(xì)胞程序性死亡。馬鈴薯StNAC053基因在擬南芥中過量表達(dá)，上調(diào)相關(guān)基因，增強(qiáng)了超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性，增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的耐受力[20]；最近研究發(fā)現(xiàn)，辣椒CaNAC55基因的表達(dá)受ABA的抑制[21]，而在水稻中，NAC轉(zhuǎn)錄因子ONAC066能抑制合成脫落酸基因的表達(dá)，積累更高的可溶性糖、氨基酸含量，提高水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性[22]，表明NAC家族基因與ABA代謝基因具有拮抗作用，并且NAC家族基因在生物脅迫中也發(fā)揮作用。迄今為止，白菜型冬油菜NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在白菜型冬油菜中還未見報道。

本研究擬利用白菜型冬油菜基因組測序數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)手段挖掘并分析白菜型冬油菜NAC基因家族成員的基本信息、系統(tǒng)進(jìn)化、共線性復(fù)制關(guān)系，通過對2個不同品種白菜型冬油菜在低溫脅迫下生長錐中BraNAC家族基因表達(dá)量的預(yù)測，并應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對2個耐旱性、抗寒性不同的白菜型冬油菜幼苗中候選BraNAC基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，然后篩選抗逆基因，以期為后續(xù)全面解析白菜型冬油菜NAC基因家族成員對多種逆境脅迫響應(yīng)的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時，一些BraNAC成員可以作為候選基因，為增強(qiáng)油菜的耐旱性和抗寒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的白菜型冬油菜試驗材料隴油7號和Lenox由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜課題組提供。隴油7號和Lenox均為白菜型冬油菜，其中，隴油7號具有強(qiáng)抗寒性和抗旱性，而Lenox的抗寒性和抗旱性較弱。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在2021年3月至10月進(jìn)行，將隴油7號和Lenox種子種植在花盆中，每盆4株，使種子在室外自然條件下生長，待植株長到5～6葉期，分別對2種材料進(jìn)行脅迫處理。低溫處理，將植株移入4 ℃低溫培養(yǎng)箱(光照14 h，黑暗10 h)，同時對同一批次的幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理(18%聚乙二醇)，處理后0 h(CK)、1 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h收集幼苗的根和葉，立即放入液氮中速凍，之后保存于-80 ℃冰箱中備用，每個處理3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 白菜型冬油菜NAC家族成員的生物信息學(xué)分析

1.3.1 白菜型冬油菜全基因組的鑒定 白菜型冬油菜隴油7號基因組序列文件由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜課題組提供；用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)下載NAM隱馬爾可夫結(jié)構(gòu)模型PF02365，使用HMMER搜索可能存在的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族序列，并除去冗余。利用在線軟件SMART(https://www.omicsclass.com/article/681)和NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對已獲取的NAC蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，最終得到含有保守BraNAC結(jié)構(gòu)域的基因序列。同時，使用在線軟件ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)對所有家族成員氨基酸序列的氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、等電點、親水性、脂肪指數(shù)等進(jìn)行預(yù)測。利用Plant-mPLoc( https://www.omicsclass.com/article/1438)預(yù)測NAC家族蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

1.3.2NAC基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹 基于已有候選基因家族蛋白質(zhì)氨基酸序列全長，利用相鄰接(Neighbor-joining)法在MEGA7軟件中構(gòu)建進(jìn)化樹，參數(shù)為默認(rèn)值。

1.3.3NAC基因的染色體定位、共線性關(guān)系和啟動子順式作用元件分析 用所得NAC家族信息繪制基因在染色體上的位置圖，同時用TBtools繪制共線性圖；提取白菜型冬油菜候選BraNAC基因上游1 500 bp啟動子序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫分析順式作用元件，并繪制相關(guān)圖表。

1.3.4 白菜型冬油菜NAC基因結(jié)構(gòu)及保守模型分析 利用已有白菜型冬油菜NAC基因家族DNA和蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)序列，使用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)繪制內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖；根據(jù)NAC基因ID從基因組注釋文件中提取注釋信息，搜索獲得的家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，利用MEME在線軟件(http://meme-suite.org)分析BraNAC家族的保守基序，參數(shù)設(shè)置為在所有序列中最多找到15個、motif長度為6～50個氨基酸。使用TBtools軟件繪制基因結(jié)構(gòu)和保守模型圖。

1.3.5 低溫脅迫下BraNAC家族的表達(dá)預(yù)測 利用白菜型冬油菜隴油7號和Lenox的生長錐中BraNAC基因在冷脅迫時的表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出BraNAC家族基因的表達(dá)量，使用TBtools軟件繪制熱圖。

1.3.6 RNA提取及熒光定量PCR 樣品使用天根生化科技(北京)有限公司RNAprep pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶，利用PrimeScript RTrea-gent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程 (大連) 有限公司產(chǎn)品]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到單鏈cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測BraNAC基因的表達(dá)情況，所用引物見表1。各個樣品檢測重復(fù)3次，所得的數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法計算分析，以Actin內(nèi)參基因作為對照。利用TBtools軟件繪制表達(dá)熱圖。

表1 實時熒光定量RT-qPCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜型冬油菜家族成員的鑒定

利用生物信息學(xué)分析方法從白菜型冬油菜全基因組中進(jìn)行BLAST比對，除去冗余，通過結(jié)構(gòu)域確認(rèn)，最終得到119個NAC家族成員，根據(jù)E-value值從小到大的順序，依次命名為BraNAC001～BraNAC119(表2)。BraNAC家族蛋白的相對分子質(zhì)量、氨基酸數(shù)、脂肪指數(shù)等分析結(jié)果顯示，BraNAC家族基因編碼的氨基酸數(shù)量差異明顯，最多的是BraNAC027，可編碼658個氨基酸，最少的是BraNAC036，僅編碼142個氨基酸；脂肪指數(shù)為43.68～84.04，表明脂肪鏈在蛋白質(zhì)氨基酸序列中所占比重較高，蛋白質(zhì)均為脂溶性蛋白質(zhì)；等電點最小的是BraNAC023編碼的蛋白質(zhì)(4.47)，最大的是BraNAC083編碼的蛋白質(zhì)(9.54)，既有酸性氨基酸，又有堿性氨基酸；親水性指數(shù)為-6.060～-0.280，為親水性蛋白質(zhì)；相對分子質(zhì)量為16 529.18～71 967.59；亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，BraNAC家族蛋白質(zhì)成員在細(xì)胞中分布廣泛，大部分分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，BraNAC006、BraNAC015、BraNAC021、BraNAC067、BraNAC083定位在線粒體中，BraNAC050、BraNAC108定位在質(zhì)膜上，BraNAC119定位在高爾基體中。在液泡、過氧化物體和細(xì)胞骨架中都發(fā)現(xiàn)了BraNAC家族蛋白，表明白菜型冬油菜NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員可能在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中具有不同的功能。

表2 BraNAC基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

2.2 BraNAC家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖1可知，119個白菜型冬油菜NAC家族成員被分為8個亞族。各亞族基因數(shù)目不一，第Ⅷ亞家族成員最少，僅包括5個基因，分支也較少，說明第Ⅷ亞家族基因同源性強(qiáng)；第Ⅵ和第Ⅰ亞家族數(shù)目最多，各包括25個家族成員，第Ⅰ亞家族分支數(shù)比第Ⅵ亞家族多，說明第Ⅰ亞家族的結(jié)構(gòu)較為多樣；BraNAC040在亞家族Ⅱ中的一級分支上，該基因可能行使亞家族Ⅱ的最基本功能；并且各個亞家族之間各級分支數(shù)、各分支基因數(shù)目不相同，表明每一個亞家族在同源結(jié)構(gòu)域相同的情況下，還存在一些短的特異序列，這些序列可能為BraNAC家族功能多樣性奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 BraNAC基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 BraNAC基因家族染色體定位

由圖2可以看出，BraNAC家族基因在10條染色體上都有分布，且在每條染色體上的數(shù)目各不相同。其中，3號染色體上分布的BraNAC基因數(shù)最多，有21個；在4號和8號染色體上分布的BraNAC基因數(shù)最少，各有4個；9號染色體最長，含有10個BraNAC家族成員。在1號、2號、3號、5號、6號、7號、10號染色體上含有較多BraNAC基因，距離較近。有31個(占比：26.05%)基因形成了13個串聯(lián)基因簇，表明串聯(lián)重復(fù)在BraNAC家族的擴(kuò)展中發(fā)揮著重要作用。

矩形表示串聯(lián)重復(fù)基因。

2.4 BraNAC基因家族共線性復(fù)制關(guān)系分析

基因復(fù)制在生物體進(jìn)化中發(fā)揮重要作用，復(fù)制的基因為植物個體的生理和形態(tài)變化奠定基礎(chǔ)[23]。為了探究白菜型冬油菜NAC家族基因的串聯(lián)重復(fù)關(guān)系，通過序列比對篩選BraNAC基因家族存在串聯(lián)重復(fù)的基因，結(jié)果如圖3所示。對119個BraNAC家族成員進(jìn)行復(fù)制鑒定，發(fā)現(xiàn)10條染色體上有91個BraNAC家族基因發(fā)生了87對片段復(fù)制。表明BraNAC基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了一定規(guī)模的復(fù)制事件，導(dǎo)致BraNAC家族成員迅速擴(kuò)張。

A01～A10表示1號染色體～10號染色體。

2.5 BraNAC基因家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域、順式作用元件和基因結(jié)構(gòu)分析

為了明確BraNAC基因家族蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點，分析了保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4所示，不同亞家族含有不同的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)目和種類，并且保守結(jié)構(gòu)域的序列長度各不相同。除第Ⅷ亞家族的成員含有6個保守結(jié)構(gòu)域之外，其他各個亞家族結(jié)構(gòu)域的數(shù)目都是4個，Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 7、Motif 8在亞家族Ⅰ～Ⅶ當(dāng)中的數(shù)目較多，結(jié)構(gòu)相對保守，表明這些結(jié)構(gòu)域在BraNAC基因家族功能的發(fā)揮方面具有重要作用；而第Ⅷ亞家族保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量增多，種類與其他各個亞家族不同。分析白菜型冬油菜上游1 500 bp啟動子序列，如圖4所示，大多數(shù)BraNAC家族成員上游主要有LTR、MBS、WUN-motif、GCN4_motif、CAAT-box、G-box、ABRE、TGA-element、GARE-motif等順式作用元件，各個啟動子的具體特征見表3。通過對BraNAC家族基因的結(jié)構(gòu)分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，不同亞家族外顯子和內(nèi)含子數(shù)量存在差異，同一組內(nèi)的數(shù)目相近。BraNAC036沒有內(nèi)含子，其他成員含有2～6個，亞家族Ⅰ和Ⅷ的內(nèi)含子長度相比于其他亞家族明顯增加，猜測這2個亞家族某些生物學(xué)功能可能發(fā)生了變化；亞家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的外顯子數(shù)目都是3個，亞家族Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ外顯子有4～6個；亞家族Ⅷ外顯子平均數(shù)達(dá)到了8個，與基因的保守性結(jié)構(gòu)域相吻合，表明亞家族Ⅷ的BraNAC成員在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了功能分化。

motif表示保守結(jié)構(gòu)域； TGA-box表示順式作用元件；UTR、CDS表示基因結(jié)構(gòu)；LTR、MBS、WUN-motif、GCN4_motif、CAAT-box、G-box、ABRE、TGA-element、GARE-motif見表3。

表3 白菜型冬油菜NAC基因家族順式作用元件

2.6 低溫脅迫下白菜型冬油菜BraNAC基因的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步了解白菜型冬油菜NAC家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，根據(jù)BraNAC基因在低溫脅迫下的表達(dá)，分析2個不同品種白菜型冬油菜BraNAC基因在生長錐中的表達(dá)。由圖5可知，在低溫脅迫下，不同品種和不同處理時長BraNAC基因的表達(dá)變化不同，BraNAC097、BraNAC073、BraNAC095、BraNAC001、BraNAC061、BraNAC014、BraNAC033、BraNAC005、BraNAC115、BraNAC058、BraNAC003在隴油7號和Lenox中上調(diào)表達(dá)，BraNAC034、BraNAC051、BraNAC052、BraNAC025、BraNAC057、BraNAC118下調(diào)表達(dá)；冷處理初期，在隴油7號中上調(diào)表達(dá)的BraNAC家族基因少于Lenox，隨著脅迫時間的增加，在隴油7號中上調(diào)表達(dá)的BraNAC家族基因明顯多于Lenox。表明大部分BraNAC基因可能通過上調(diào)表達(dá)使白菜型冬油菜適應(yīng)低溫環(huán)境。

圖5 低溫脅迫下BraNAC家族成員在生長錐中的表達(dá)分析

2.7 BraNAC家族基因的表達(dá)分析

基于系統(tǒng)發(fā)育和BraNAC家族基因表達(dá)數(shù)據(jù)，選擇了11個白菜型冬油菜NAC基因，分析低溫和干旱脅迫下其在根和葉中的表達(dá)變化，對2種抗逆性不同的白菜型冬油菜分別進(jìn)行低溫處理和干旱處理，利用實時熒光定量PCR來檢測BraNAC基因的表達(dá)水平。由圖6A可知，低溫脅迫下，白菜型冬油菜的根中大多數(shù)基因表達(dá)量在處理后24 h達(dá)到最大，如BraNAC012和BraNAC027在隴油7號處理24 h時表達(dá)水平明顯升高，而在Lenox中變化不明顯，BraNAC066表達(dá)量在隴油7號中變化不明顯，而在Lenox中表達(dá)上調(diào)。在低溫脅迫的葉中(圖6B), 大多數(shù)基因在Lenox中的表達(dá)水平明顯高于隴油7號，如BraNAC068在處理48 h后表達(dá)量明顯升高，且在Lenox中變化更明顯，BraNAC035在Lenox中處理24 h后具有很高表達(dá)量，BraNAC066和BraNAC015在Lenox中處理4 h后具有很高表達(dá)量，BraNAC034在處理48 h后表達(dá)水平明顯升高，而在隴油7號中表達(dá)下調(diào)；因此，BraNAC012、BraNAC027和BraNAC068可能在植物抗寒方面起到正調(diào)控作用，相反，BraNAC035、BraNAC015、BraNAC066和BraNAC034可能與植物抗寒性呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。

a1、a2、 a3、a4、a5、a6、a7分別表示隴油7號的根部對照、隴油7號的根部低溫處理1 h、隴油7號的根部低溫處理4 h、隴油7號的根部低溫處理6 h、隴油7號的根部低溫處理12 h、隴油7號的根部低溫處理24 h、隴油7號的根部低溫處理48 h。b1、b2、 b3、b4、b5、b6、b7分別表示Lenox的根部對照、Lenox的根部低溫處理1 h、Lenox的根部低溫處理4 h、Lenox的根部低溫處理6 h、Lenox的根部低溫處理12 h、Lenox的根部低溫處理24 h、Lenox的根部低溫處理48 h。

由圖7A可以看出，在干旱脅迫下，白菜型冬油菜根中BraNAC034、BraNAC012、BraNAC027和BraNAC015的表達(dá)量在干旱處理4 h、6 h、24 h后在隴油7號中與對照相比明顯上調(diào)，但在Lenox中變化不明顯。圖7B顯示，BraNAC066的表達(dá)量在隴油7號干旱處理4 h明顯升高，BraNAC012的表達(dá)量在隴油7號干旱處理6 h、48 h明顯升高，在Lenox中變化不明顯；干旱處理6 h，BraNAC068在隴油7號中的表達(dá)明顯上調(diào)；干旱處理1 h后，BraNAC072的表達(dá)量在Lenox中明顯升高，在隴油7號中沒有明顯變化；其他BraNAC基因干旱處理后在2個白菜型冬油菜品種中表達(dá)變化不明顯。因此BraNAC012、BraNAC015、BraNAC068、BraNAC066、BraNAC027、BraNAC034可能在植物抗旱方面發(fā)揮正調(diào)控的功能，BraNAC072可能與植物抗旱性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

a1、a2、 a3、a4、a5、a6、a7分別表示隴油7號的根部對照、隴油7號的根部干旱處理1 h、隴油7號的根部干旱處理4 h、隴油7號的根部干旱處理6 h、隴油7號的根部干旱處理12 h、隴油7號的根部干旱處理24 h、隴油7號的根部干旱處理48 h。b1、b2、 b3、b4、b5、b6、b7分別表示Lenox的根部對照、Lenox的根部干旱處理1 h、Lenox的根部干旱處理4 h、Lenox的根部干旱處理6 h、Lenox的根部干旱處理12 h、Lenox的根部干旱處理24 h、Lenox的根部干旱處理48 h。

3 討論

本研究利用白菜型冬油菜隴油7號基因組測序數(shù)據(jù)，經(jīng)鑒定得到119個BraNAC家族成員，聚類為8個亞家族，保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，第Ⅷ亞家族的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量增多，種類與其他各個亞家族不同?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，亞家族Ⅰ～Ⅶ的外顯子數(shù)目都是3～6個，而亞家族Ⅷ外顯子平均數(shù)達(dá)到8個，與基因的保守性結(jié)構(gòu)域數(shù)目增多相吻合，可能在功能上出現(xiàn)了分化。順式作用元件分析結(jié)果顯示，BraNAC基因含有與冷脅迫、干旱脅迫、機(jī)械損傷、胚胎發(fā)育和內(nèi)源激素調(diào)控等相關(guān)的響應(yīng)元件，與前人的研究結(jié)果[7]一致。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，BraNAC蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體中都有分布,與之前研究結(jié)果[24]相比，在細(xì)胞中分布較為廣泛，表明BraNAC基因在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了功能擴(kuò)張事件。

低溫和干旱是限制植物生長發(fā)育的重要氣候因子[25-30]，大量研究結(jié)果表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)寒冷[31]和干旱[6]信號途徑中發(fā)揮作用。在干旱脅迫下，MlNAC12大量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比，氣孔孔徑減小,活性氧(ROS)和丙二醛(MAD)積累減少，同時超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶等幾種抗氧化酶的活性顯著增強(qiáng)[32]，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的耐受性。前人研究結(jié)果表明，當(dāng)對白菜型冬油菜進(jìn)行干旱脅迫時，CAT、SOD、POD活性與抗旱性呈正相關(guān)[33]，且不同抗旱品種的CAT、SOD、POD活性變化不一樣，在抗旱性弱的品種中各酶活性一般在相對較短的時間內(nèi)變化較快。本研究利用2個抗性不同的白菜型冬油菜品種，篩選抗逆基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BraNAC012、BraNAC015、BraNAC068、BraNAC066、BraNAC027、BraNAC034都在隴油7號中干旱處理4 h后或者更長的時間后明顯大量表達(dá)，這些基因可能在Lenox中處理很短的時間內(nèi)大量表達(dá)，增強(qiáng)了白菜型冬油菜CAT、SOD和POD的活性，同時，降低ROS的含量，表現(xiàn)為植株對干旱的適應(yīng)。低溫通過影響植物體內(nèi)的酶活性，減緩生理代謝過程，使細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透勢發(fā)生改變[31]，降低植物生長速率，從而造成生長緩慢，嚴(yán)重者可導(dǎo)致幼苗生長纖弱遲緩，葉片萎蔫、黃化，果實畸形等，最后導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量下降。在低溫脅迫下，植物細(xì)胞會通過提高相關(guān)酶的活性或產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來適應(yīng)不利的環(huán)境[34]。在辣椒中，NAC家族基因CaNAC064的大量表達(dá)顯著降低植株丙二醛(MDA)含量，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Pro)含量，提高抗氧化酶活性，從而降低對低溫脅迫的敏感性[35]。本研究中，BraNAC012、BraNAC027在超強(qiáng)抗寒材料隴油7號低溫處理后表達(dá)量明顯升高，而在弱抗寒材料Lenox中變化不明顯。因此，BraNAC012、BraNAC027可能在提高白菜型冬油菜響應(yīng)低溫脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等方面發(fā)揮著重要作用。

本研究首次對白菜型冬油菜NAC家族進(jìn)行全基因組鑒定和結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)了119個BraNAC家族成員，并預(yù)測了11個可能參與寒冷、干旱脅迫的候選基因。結(jié)果表明，BraNAC012、BraNAC015、BraNAC068、BraNAC066、BraNAC027、BraNAC034可以作為候選基因，提高作物抗旱性，BraNAC027和BraNAC012可以作為提高作物抗寒性的候選基因。同時，BraNAC家族基因受不同逆境脅迫誘導(dǎo)，并且存在組織與時間表達(dá)特異性。本研究結(jié)果為今后全面解析白菜型冬油菜NAC基因的功能提供參考。