劉蓓一， 韋 青， 田吉鵬， 程云輝， 許能祥， 張文潔， 顧洪如， 路慶鵬， 劉 翔， 丁成龍

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇南京210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014；3.江蘇綠科生物技術(shù)有限公司，江蘇揚(yáng)州225600；4.睢寧縣飛翔牧業(yè)有限公司，江蘇睢寧221243)

中國(guó)的秸稈資源豐富，每年產(chǎn)量達(dá)8×108～9×108t，且有逐年增加的趨勢(shì)[1]，但是秸稈中的纖維素、木質(zhì)素含量較高，限制了秸稈在家畜養(yǎng)殖中的高效利用。秸稈中的木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素通過(guò)阿魏酸酯鍵交聯(lián)在一起[2]，而利用產(chǎn)阿魏酸酯酶(FAE)乳酸菌在青貯過(guò)程中產(chǎn)生的FAE使木質(zhì)素與多糖之間的化學(xué)鍵斷裂，進(jìn)而有效降低秸稈青貯過(guò)程中木質(zhì)纖維素含量,提高木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)性多糖在體外的酶解消化率。此外，乳酸菌在青貯過(guò)程中一直被視為有益微生物，能夠適應(yīng)青貯過(guò)程的厭氧環(huán)境，是青貯體系中啟動(dòng)乳酸發(fā)酵的關(guān)鍵因子。由此可見，篩選出具有較高阿魏酸酯酶活性的乳酸菌非常重要。

反芻動(dòng)物瘤胃中含有大量纖維分解菌[3]，能夠?qū)㈦y以消化的粗飼料降解成揮發(fā)性脂肪酸(如乙酸、丙酸、丁酸等)，從而為反芻動(dòng)物提供能量[4]。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的纖維降解菌主要是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等[5]，但是這些都是嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌，而青貯是從有氧期進(jìn)入?yún)捬跗诘倪^(guò)程，篩選兼性厭氧纖維降解菌意義較大。李君風(fēng)等[6]從西藏地區(qū)牦牛瘤胃液中分離到1株能降解水稻秸稈纖維素、半纖維素的兼性厭氧纖維素降解菌，經(jīng)鑒定為糞腸球菌。目前，還未見從動(dòng)物瘤胃液中篩選出產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌的報(bào)道。

將篩選到的產(chǎn)阿魏酸酯酶的乳酸菌應(yīng)用到秸稈青貯中，既可以發(fā)揮乳酸菌自身的優(yōu)勢(shì)，又能利用阿魏酸酯酶的特性進(jìn)一步降解秸稈纖維，從而提高青貯秸稈的綜合品質(zhì)和利用率。本試驗(yàn)擬從湖羊瘤胃液中篩選產(chǎn)阿魏酸酯酶的乳酸菌，并鑒定菌株特性，進(jìn)而將其接種到水稻秸稈青貯中，研究其對(duì)青貯水稻秸稈纖維降解率及青貯飼料品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

選擇健壯的湖羊，用瘤胃導(dǎo)管從胃部預(yù)留孔中采集瘤胃液并置于無(wú)菌保溫瓶中，隨后將采集的瘤胃液迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌紗布過(guò)濾，進(jìn)而進(jìn)行梯度稀釋。

1.2 羊瘤胃液中乳酸菌的篩選

選擇3個(gè)合適梯度的瘤胃液稀釋液，各取100 μl，按照3點(diǎn)法添加到MRS(Man Rogosa Sharpe)培養(yǎng)基平板上，均勻涂布后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置厭氧培養(yǎng)48 h。挑選形態(tài)各異的菌落，繼續(xù)在MRS培養(yǎng)基上反復(fù)劃線，直至得到純化的單菌落，繼續(xù)進(jìn)行革蘭氏染色和H2O2酶試驗(yàn)。

1.3 產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌的初篩

用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，點(diǎn)接在篩選培養(yǎng)基[7]上，于30 ℃培養(yǎng)12～72 h，觀察單菌落是否在平板上出現(xiàn)明顯的透明圈。若出現(xiàn)透明圈，可初步認(rèn)為該菌株具有產(chǎn)阿魏酸酯酶的能力。

1.4 產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌的復(fù)篩

1.4.1 阿魏酸(FA)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取5個(gè)100 ml的容量瓶，按1～5編號(hào)，反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水的體積參照表1，每組設(shè)3個(gè)平行。將反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水混勻，分別得到質(zhì)量濃度為50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml、250 μg/ml的反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)液過(guò)0.22 μm濾膜后，進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)測(cè)定，用測(cè)得的數(shù)值繪制阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)液的配方

1.4.2 發(fā)酵液的準(zhǔn)備 將初篩獲得的產(chǎn)阿魏酸酯酶的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，將菌體用0.9%無(wú)菌生理鹽水洗滌2～3次并重置于去離子水中。按5%接種量接種菌懸液于新鮮的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵[7]，再于37 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定初篩獲得的乳酸菌的阿魏酸酯酶活性。將發(fā)酵培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min，獲得上清液。

1.4.3 酶活性的測(cè)定 取2支試管，參照表2配方加入各試劑，每組設(shè)3個(gè)平行, 混勻后于30 °C水浴30 min，沸水浴10 min后終止反應(yīng)，再于10 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)濾并進(jìn)行HPLC測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算阿魏酸的質(zhì)量濃度，將1 min內(nèi)分解阿魏酸甲酯產(chǎn)生1 μmol阿魏酸需要的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U)，計(jì)算公式：

表2 阿魏酸酯酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系

酶活性(mU/ml)=反應(yīng)液中阿魏酸的平均含量(μg)/阿魏酸摩爾質(zhì)量×反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.4.4 HPLC色譜條件 C18色譜柱為Synergi Hydro-RP80(250.0 mm×4.6 mm, 4 μm)。流動(dòng)相A(甲醇)∶流動(dòng)相B(1%冰乙酸)=28∶72。流速為0.6 ml/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)(UV)為 320 nm，進(jìn)樣量為10 μl。

1.5 產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌的復(fù)篩

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌株在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形狀、顏色、大小及邊緣等特征，同時(shí)挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察鏡檢結(jié)果。

1.5.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取1環(huán)乳酸菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h。取菌懸液，按5%接種量分別接種至液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)0～24 h，每隔2 h取1管，測(cè)定其OD600和pH值，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.5.3 生長(zhǎng)特性的鑒定

1.5.3.1 耐酸試驗(yàn) 取1環(huán)乳酸菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h。取菌懸液，按5%接種量分別接種至不同pH值(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、7.0)的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，目測(cè)菌株生長(zhǎng)情況[8]。

1.5.3.2 耐高溫、低溫試驗(yàn) 取1環(huán)乳酸菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h。取菌懸液，按5%接種量分別接種至MRS液體培養(yǎng)基中，分別在5 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃下培養(yǎng)， 其中在5 ℃、15 ℃下培養(yǎng)120 h，在25 ℃、35 ℃下培養(yǎng)48 h，在45 ℃下培養(yǎng)96 h[8]。

1.5.3.3 耐鹽試驗(yàn) 取1環(huán)乳酸菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h。取菌懸液，按5%接種量分別接種至含有3.0%、6.5%、10.0%、15.0% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，目測(cè)菌株生長(zhǎng)情況[8]。

1.5.4 生化鑒定 分別挑取乳酸菌的單菌落進(jìn)行生化檢測(cè)，使用細(xì)菌生化鑒定管(購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司)進(jìn)行測(cè)定，按反應(yīng)管試劑盒中的說(shuō)明書進(jìn)行操作，隨后培養(yǎng)2～3 d，記錄菌株反應(yīng)情況，并結(jié)合凌代文[9]的方法推測(cè)菌株所屬類型。

1.5.5 16S rDNA測(cè)序鑒定 優(yōu)勢(shì)菌株培養(yǎng)48 h后，取細(xì)菌培養(yǎng)液于10 000 r/min離心1 min，棄去上層澄清液，收集底層菌體以備提取樣品DNA，DNA提取方法參照TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序返回的有效序列拼接后在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)，利用Mega 11.0軟件，選擇Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 稻草青貯的調(diào)制、青貯品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的分析

1.6.1 水稻秸稈青貯的調(diào)制 在2021年10月收割水稻，以去穗粳稻秸稈作為青貯原料。水稻秸稈原料pH值為6.13，營(yíng)養(yǎng)成分：干物質(zhì)(DM)含量 372.99 g/kg，粗蛋白含量47.06 g/kg(DM), 可溶性碳水化合物含量 36.84 g/kg(DM), 中性洗滌纖維含量632.41 g/kg(DM)，酸性洗滌纖維含量399.58 g/kg(DM)，酸性洗滌木質(zhì)素含量36.86 g/kg(DM)，纖維素含量362.72 g/kg(DM)，半纖維素含量232.83 g/kg(DM)，乳酸含量7.78 g/kg(DM)，乙酸含量0.72 g/kg(DM)，1 g水稻秸稈(以鮮質(zhì)量計(jì))含乳酸菌數(shù)量4.76 lg、好氧細(xì)菌數(shù)6.64 lg、酵母菌數(shù)量4.55 lg，霉菌數(shù)量3.02 lg。 在水稻秸稈中分別添加鼠李糖乳桿菌(SR1)、香腸乳桿菌(SR2)，添加量均為5×105CFU/g，將菌劑噴灑于水稻秸稈上，對(duì)照組噴灑相應(yīng)體積的水。將處理后的水稻秸稈裝入青貯袋中，使用真空封口機(jī)抽氣封口，每袋質(zhì)量300 g。室溫發(fā)酵60 d后開袋取樣，進(jìn)行青貯品質(zhì)的檢測(cè)。

1.6.2 水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量的測(cè)定 取20 g原水稻秸稈樣品或青貯樣品，加入180 ml滅菌蒸餾水，于4 ℃冰箱中浸提24 h，再用4層紗布過(guò)濾，隨后用pH計(jì)測(cè)定濾液pH值。將濾液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后用高效液相色譜儀測(cè)定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量[10]。用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定銨態(tài)氮含量[11]。

取10 g原水稻秸稈樣品或青貯樣品裝入含有90 ml 0.90%生理鹽水的6號(hào)自封袋中，置于搖床上，于120 r/min振蕩1 h，取上清菌懸液進(jìn)行不同梯度的稀釋。將具有連續(xù)稀釋度的菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算好氧細(xì)菌的數(shù)量；將具有連續(xù)稀釋度的菌液涂布于虎皮瓊脂培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算酵母菌、真菌的數(shù)量；將具有連續(xù)稀釋度的菌液灌注于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算乳酸菌數(shù)量[12]。

1.6.3 水稻秸稈青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的測(cè)定 每袋稱取250 g原水稻秸稈樣品(原料)或青貯樣品，于105 ℃殺青1 h后，再于65 ℃烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算干物質(zhì)含量。用ANKOM -A2000i型全自動(dòng)濾袋技術(shù)測(cè)定樣品、原料的中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)含量，并計(jì)算纖維素、半纖維素含量[13]；用丹麥產(chǎn)全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量[14]；用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定可溶性碳水化合物含量[15]；用體外胃蛋白酶-纖維素酶消化法測(cè)定干物質(zhì)體外消化率[16]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019、SPSS 26軟件統(tǒng)計(jì)并分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Duncan’s 法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌菌株的篩選

本試驗(yàn)從湖羊瘤胃液中分離到156株乳酸菌，在以阿魏酸乙酯為唯一碳源的篩選平板上培養(yǎng)12 h后發(fā)現(xiàn)，僅SR1菌株、SR2菌株產(chǎn)生較大透明圈，可以初步判斷SR1菌株、SR2菌株能利用碳源阿魏酸乙酯，可能具有產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性，其中SR1菌株、SR2菌株的透明圈直徑分別為8.00 mm、12.00 mm，與SR1菌株相比，SR2菌株的透明圈直徑更大，表明該菌株降解阿魏酸乙酯的性能更好。

由表3可以看出，SR1菌株、SR2菌株都具有產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性，SR1產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性為7.23 mU/ml，菌株SR2產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性高于SR1，為10.36 mU/ml。

表3 SR1菌株、SR2菌株的透明圈大小及其產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將SR1菌株、SR2菌株分別劃線接種于含瓊脂的MRS培養(yǎng)基上，于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)SR1菌株在平板上形成乳白色、圓形、邊緣規(guī)則、中心凸起且表面有光澤的菌落；SR2菌株為中心稍凸起的乳白色菌落，邊緣不整齊，表面濕潤(rùn)，呈扁平狀。培養(yǎng)48 h后進(jìn)行涂片染色，SR1菌株、SR2菌株的鏡檢結(jié)果均為G+短桿菌。

2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線

由圖1A可知，隨著菌株SR1的生長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH值逐漸下降。從OD600看出，培養(yǎng)0～2 h，SR1菌株生長(zhǎng)緩慢，處在停滯期；培養(yǎng)2～16 h，SR1菌株步入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速率最快；培養(yǎng)16 h后，SR1菌株的生長(zhǎng)步入平緩期，生長(zhǎng)逐漸穩(wěn)定；培養(yǎng)24 h時(shí)，SR1菌株培養(yǎng)液的pH值為3.94。

由圖1B中SR2菌株的OD600、pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化可以看出，SR2菌株在培養(yǎng)2 h后的繁殖速度加快，步入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)產(chǎn)酸能力也相應(yīng)提高，pH值快速下降；培養(yǎng)18 h后，SR2菌株的生長(zhǎng)逐漸趨于穩(wěn)定，pH值緩慢降低；培養(yǎng)24 h時(shí)，SR2菌株培養(yǎng)液的pH值為3.83。綜合分析可知，SR2菌株的產(chǎn)酸速度比SR1菌株快。

A：SR1菌株；B：SR2菌株。

2.4 菌株的生長(zhǎng)特性

由表4可知，在pH值為2.5的條件下，2株菌均不能生長(zhǎng)；當(dāng)pH值為3.0時(shí)，SR1菌株表現(xiàn)為微弱生長(zhǎng)，SR2菌株的生長(zhǎng)表現(xiàn)一般；當(dāng)pH值為3.5～7.0時(shí)，SR2菌株的生長(zhǎng)情況良好。2株菌在5 ℃條件下均不能生長(zhǎng)；在25～37 ℃條件下，2株菌的生長(zhǎng)狀況良好；當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，2株菌的生長(zhǎng)情況均較微弱。2株菌都能在含有3.0%～10.0% NaCl的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。當(dāng)NaCl含量達(dá)到15.0%時(shí)，SR1菌株、SR2菌株均不生長(zhǎng)。由此可見，SR1菌株能夠在pH值為4.0～7.0、溫度為25～37 ℃、NaCl含量為3.0%的MRS培養(yǎng)液中良好生長(zhǎng)； SR2菌株的耐酸能力比SR1菌株高，能夠在pH值為3.5～7.0、溫度為25～37 ℃、NaCl含量為3.0%的MRS培養(yǎng)液中很好地生長(zhǎng)。

表4 菌株在不同條件下的生長(zhǎng)情況

2.5 菌株的生化反應(yīng)

由表5可以看出，SR1菌株、SR2菌株在乳糖、蔗糖和葡萄糖生化管中的反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)為陽(yáng)性，硝酸鹽還原和接觸酶反應(yīng)結(jié)果均表現(xiàn)為陰性，表明SR1菌株在葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣試驗(yàn)中表現(xiàn)為產(chǎn)氣，SR2菌株發(fā)生精氨酸產(chǎn)氨現(xiàn)象；SR1菌株在阿拉伯糖、核糖、甘露醇和山梨醇生化管中的反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)為陽(yáng)性，SR2菌株則相反。結(jié)合凌代文[9]的研究結(jié)果，初步判斷SR1菌株為鼠李糖乳桿菌，SR2菌株為香腸乳桿菌。

表5 不同菌株的生化反應(yīng)結(jié)果

2.6 16S rRNA鑒定

由表6、圖2可知，SR1菌株與Lactobacillusrhamnosusstrain NBRC 3425最接近，同源性達(dá)99.79%；SR2菌株與Lactobacillusfarciminisstrain BCRC 14043最接近，同源性達(dá)99.00%以上。綜合SR1菌株、SR2菌株的形態(tài)學(xué)、理化特征及16S rRNA測(cè)序結(jié)果，最終鑒定SR1菌株為鼠李糖乳桿菌，SR2菌株為香腸乳桿菌。

圖2 2個(gè)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表6 基于16S rRNA序列的NCBI比對(duì)結(jié)果

2.7 接種產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌對(duì)水稻秸稈青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表7可以看出，水稻秸稈青貯發(fā)酵60 d后，與CK相比，SR2組的pH值顯著低于CK(P<0.05)，且SR2組的pH值最低，SR1組的pH值與CK間的差異不顯著。SR2組的乳酸含量顯著高于CK、SR1組(P<0.05)；與CK相比，SR2組的乙酸含量顯著降低(P<0.05)，而SR1組的乙酸含量顯著升高(P<0.05)。SR2組的乳酸與乙酸含量的比值比CK高564.58%，并且差異顯著(P<0.05)。SR2組的銨態(tài)氮含量比CK減少了60.63%, 并且顯著低于SR1組(P<0.05)。SR1組與CK的銨態(tài)氮含量差異不顯著。SR2組的乳酸菌數(shù)量顯著高于CK(P<0.05)，SR1組的乳酸菌數(shù)量與CK間的差異不顯著；SR2組的好氧細(xì)菌數(shù)量和酵母菌數(shù)量顯著低于CK、SR1組(P<0.05)。所有處理組中均未檢測(cè)出丙酸、丁酸或霉菌。

表7 接種乳酸菌對(duì)水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)的影響

2.8 接種產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌對(duì)水稻秸稈青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表8可以看出，青貯60 d后SR2組的干物質(zhì)含量顯著高于CK、SR1組(P<0.05)，SR1組的干物質(zhì)含量與CK間無(wú)顯著差異；SR1組的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于CK(P<0.05)。SR2組的可溶性碳水化合物含量比CK增加了42.67%，并且差異顯著(P<0.05)。SR2組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素含量顯著低于CK(P<0.05)，分別降低了3.03%、4.74%、4.90%，SR1組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素含量與CK之間的差異不顯著；SR2組的干物質(zhì)體外消化率最高，但與CK相比差異不顯著，僅提高了2.26%。

表8 接種乳酸菌對(duì)水稻秸稈青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 羊瘤胃液中產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌的篩選與鑒定

有報(bào)道顯示，反芻動(dòng)物瘤胃中近50%的纖維素被分解，是瘤胃中細(xì)菌、真菌、原蟲協(xié)同作用的結(jié)果[17]。而在分解過(guò)程中，80%左右是由細(xì)菌完成的，反芻動(dòng)物瘤胃中的細(xì)菌可以產(chǎn)生木聚糖酶、纖維素酶等能降解纖維素的活性物質(zhì)。由此進(jìn)一步推測(cè)，反芻動(dòng)物瘤胃中可能存在獨(dú)特的具有阿魏酸酯酶活性的資源。阿魏酸酯酶在一定程度上具有降解纖維素的能力，能夠反映反芻動(dòng)物對(duì)纖維素的利用程度。由此可見，從反芻動(dòng)物瘤胃中篩選具有阿魏酸酯酶活性的細(xì)菌并測(cè)定其產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱，對(duì)于判斷反芻動(dòng)物瘤胃中纖維素被分解的程度具有參考意義。

反芻動(dòng)物瘤胃中微生物分泌出的酶可以存在于瘤胃液中，也可以附著在飼料顆粒及微生物菌體上[18]，其中葡聚糖酶分布于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞表面，而阿魏酸酯酶、糖苷分解酶主要分布于瘤胃液中。由此可見，瘤胃中具有阿魏酸酯酶活性的微生物與植物細(xì)胞壁上附著的微生物對(duì)纖維素的降解極其重要。

在本試驗(yàn)中，研究人員從湖羊瘤胃液中篩選得到2株具有阿魏酸酯酶活性的菌株，并結(jié)合形態(tài)學(xué)、理化性質(zhì)、基因測(cè)序鑒定結(jié)果，確定其中的SR1菌株、SR2菌株均為乳桿菌屬。通過(guò)產(chǎn)酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，這2株菌產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性顯著低于目前已知的具有產(chǎn)阿魏酸酯酶的真菌，與李干等[19-20]報(bào)道的研究結(jié)果一致。但與其他細(xì)菌相比，菌株SR2的產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性要高于乳酸片球菌(4.32 mU/ml)、短乳桿菌(7.56 mU/ml)、植物乳桿菌(8.34 mU/ml)[21]，表明本研究獲得的SR2菌株具有降解阿魏酸甲酯的作用。綜合這2株菌的透明圈大小及其產(chǎn)酶活性可知，菌株SR2對(duì)阿魏酸甲酯的分解能力要優(yōu)于菌株SR1。對(duì)2株菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，菌株SR2的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，其在MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，最終MRS培養(yǎng)液的pH值達(dá)到3.83，而菌株SR1的產(chǎn)酸能力較弱，培養(yǎng)24 h后MRS培養(yǎng)液的pH值為3.94。在對(duì)酸、鹽和溫度的耐受性上，SR1、SR2這2株菌的生長(zhǎng)受到pH值、鹽濃度及溫度的影響，2株菌在低溫(5 ℃)、高鹽含量(15.0% NaCl)條件下不能生長(zhǎng)，但在溫度為25～45 ℃、NaCl含量為3.0%～10.0%的條件下能夠微弱生長(zhǎng)，并且SR1、SR2這2株菌能在pH值為3.0的MRS培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，與薛銀剛等[22-23]報(bào)道的結(jié)果相符，且SR2(香腸乳桿菌)對(duì)酸的耐受性更強(qiáng)。Muck等[24]認(rèn)為，適合用于青貯的微生物發(fā)酵劑應(yīng)有一致的發(fā)酵途徑，既可以利用糖來(lái)提高產(chǎn)酸量，使青貯飼料的pH值盡快降至4.0，從而阻礙有害微生物活動(dòng)，改善飼料品質(zhì)，同時(shí)，這類微生物發(fā)酵劑需要具備一定的耐酸性。由此可見，產(chǎn)酸量和耐酸性是評(píng)價(jià)乳酸菌在青貯過(guò)程中發(fā)酵性能的重要指標(biāo)。Zhou等[25]認(rèn)為，參與青貯發(fā)酵的乳酸菌的最佳生長(zhǎng)環(huán)境溫度為20～37 ℃，過(guò)高或過(guò)低的溫度都會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究選用的2株乳酸菌在pH值為3.0、溫度為25～37 ℃的環(huán)境中也能生長(zhǎng)，在作為青貯料乳酸菌添加劑的生產(chǎn)中具有潛在價(jià)值。

3.2 功能性乳酸菌對(duì)水稻秸稈青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

pH值下降速度是影響微生物活動(dòng)和發(fā)酵損失的重要因素[26]。添加乳酸菌能夠促進(jìn)青貯飼料酸化，使得pH值下降，發(fā)酵速度加快且發(fā)酵產(chǎn)物含量發(fā)生改變[27]。賈婷婷等[28]發(fā)現(xiàn)，外源添加鼠李糖乳桿菌后，會(huì)引起青貯水稻秸稈pH值降低、乳酸含量提高、有害菌數(shù)量減少，與本研究結(jié)果不一致。造成上述結(jié)果不一致的原因可能是水稻秸稈發(fā)酵60 d后，含水率、營(yíng)養(yǎng)水平較低，阻礙了乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，從而影響其發(fā)酵效果。而添加香腸乳桿菌的SR2組的pH值顯著降低至3.91，達(dá)到制備優(yōu)質(zhì)青貯料的要求。SR2組水稻秸稈青貯60 d時(shí)，乳酸菌數(shù)量增加，好氧細(xì)菌、酵母菌數(shù)量減少，基本檢測(cè)不到霉菌，說(shuō)明香腸乳桿菌SR2的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，促使青貯水稻秸稈的pH值迅速降低，不良微生物減少。

有機(jī)酸也是判定青貯水稻秸稈發(fā)酵品質(zhì)的主要指標(biāo)，尤其是乳酸含量與發(fā)酵品質(zhì)高度相關(guān)。水稻秸稈青貯時(shí)，添加鼠李糖乳桿菌SR1后，乙酸含量顯著高于其他處理組，可能與鼠李糖乳桿菌為異型發(fā)酵乳酸菌有關(guān)；添加香腸乳桿菌的SR2組與CK組、SR1組相比，乳酸含量分別增加了114.53%、97.57%，表明添加香腸乳桿菌SR2促進(jìn)了乳酸的生成。產(chǎn)阿魏酸酯酶的香腸乳桿菌SR2的添加對(duì)青貯飼料中乙酸含量的影響較大，明顯降低了乙酸含量，提高了乳酸/乙酸比值，這是添加同型乳酸菌后產(chǎn)生的典型反應(yīng)[29-30]。

銨態(tài)氮由腐敗微生物(如梭菌)降解青貯原樣中的粗蛋白產(chǎn)生，其含量越高，表明發(fā)酵效果越差。添加功能性乳酸菌會(huì)使青貯料中的乳酸菌數(shù)量增加，而乳酸菌可以產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，對(duì)一些不良菌的發(fā)育有阻礙作用。添加功能性乳酸菌后，銨態(tài)氮含量都有所降低，其中添加產(chǎn)阿魏酸酯酶的香腸乳桿菌SR2的效果最明顯，銨態(tài)氮含量顯著低于其他處理組，說(shuō)明添加產(chǎn)阿魏酸酯酶的香腸乳桿菌SR2能有效減少腐敗菌對(duì)水稻秸稈原料中粗蛋白的降解，進(jìn)而改善青貯水稻秸稈飼料的品質(zhì)，這與華金玲[31]和荊佩欣[21]的研究結(jié)果一致。

3.3 功能性乳酸菌對(duì)水稻秸稈青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

粗蛋白含量體現(xiàn)了水稻秸稈飼料的飼用價(jià)值。在發(fā)酵過(guò)程中，植物酶和微生物的作用會(huì)影響粗蛋白含量。在本試驗(yàn)中，SR1處理組的粗蛋白含量高于未加菌劑的CK。

在水稻秸稈青貯過(guò)程中，纖維含量和結(jié)構(gòu)的變化受酶活性的影響，進(jìn)一步會(huì)影響水稻秸稈青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[32]。從營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)來(lái)看，添加鼠李糖乳桿菌的SR1處理組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量與CK間基本無(wú)差異，與Lynch等[33]報(bào)道的結(jié)果相似，Lynch等在添加產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌苜蓿青貯試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接種產(chǎn)阿魏酸酯酶的乳酸菌沒有提高青貯苜蓿發(fā)酵品質(zhì)及纖維降解能力，可能是由于在單獨(dú)添加鼠李糖乳桿菌SR1的條件下，水稻秸稈發(fā)酵60 d后的pH值仍偏高，鼠李糖乳桿菌SR1的阿魏酸酯酶未發(fā)揮作用，可溶性糖釋放不及時(shí)，使得鼠李糖乳桿菌SR1在水稻秸稈表面不能很好地生長(zhǎng)。而在添加產(chǎn)阿魏酸酯酶的香腸乳桿菌SR2處理中，水稻秸稈飼料中的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和纖維素含量較CK顯著降低，可溶性碳水化合物含量較CK顯著增加。荊佩欣[21]研究發(fā)現(xiàn)，加入產(chǎn)阿魏酸酯酶的植物乳桿菌A1，可以導(dǎo)致苜蓿青貯飼料的纖維含量降低。Nsereko等[34]在禾本科牧草青貯過(guò)程中添加阿魏酸酯酶，促進(jìn)了牧草飼料中中性洗滌纖維的降解，但對(duì)干物質(zhì)體外消化率沒有影響，表明阿魏酸酯酶能起到降解纖維的作用，與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

(1)接種產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌提高了水稻秸稈飼料發(fā)酵品質(zhì)，產(chǎn)阿魏酸酯酶香腸乳桿菌SR2組發(fā)酵60 d后的pH值最低，為3.91，乳酸含量最高，為69.25 g/kg。所有菌劑處理組的銨態(tài)氮含量均低于CK，其中產(chǎn)阿魏酸酯酶的香腸乳桿菌SR2組的銨態(tài)氮含量最低。(2)產(chǎn)阿魏酸酯酶香腸乳桿菌SR2組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和纖維素含量分別為621.63 g/kg、384.96 g/kg和349.77 g/kg，顯著低于CK，添加產(chǎn)阿魏酸酯酶的鼠李糖乳桿菌SR1組對(duì)水稻秸稈纖維分解的影響不大。產(chǎn)阿魏酸酯酶的香腸乳桿菌SR2組的可溶性碳水化合物含量最高，為13.34 g/kg。綜上各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，得出產(chǎn)阿魏酸酯酶的香腸乳桿菌SR2組為發(fā)酵效果最優(yōu)組。