邵 穎， 肖福泉， 王麗麗， 龔柳菲， 宋祥軍， 涂 健， 祁克宗

(1.獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036；2.安徽省動(dòng)物性食品質(zhì)量與生物安全工程實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036)

禽腺病毒對(duì)養(yǎng)禽業(yè)有很大的隱患，許多家禽品種，如雞、鴨、鵝等都會(huì)被感染。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)屬于感染最為嚴(yán)重的I群禽腺病毒，不僅可以經(jīng)口、經(jīng)糞水平傳播，而且還可以通過種蛋垂直傳播[1]。FAdV-4侵染后主要以禽的心包積液和包涵體肝炎為病理特征，在世界各地都有發(fā)生。FAdV-4侵害3～5周齡肉雞和蛋雛雞，感染率高達(dá)90%以上，死亡率可高達(dá)80%[2-3]。FAdV-4是養(yǎng)殖業(yè)中致病的主要流行株，一直以來給中國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

目前常用的檢測(cè)FAdV-4的方法有PCR、間接ELISA與IFA等。這些方法大都來自實(shí)驗(yàn)室，要求較高的專業(yè)技術(shù)，操作過程繁瑣且檢測(cè)儀器昂貴，對(duì)于大規(guī)模的臨床檢測(cè)來說費(fèi)時(shí)費(fèi)力[6]。熒光免疫層析因快捷簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)等方面[7]。即時(shí)檢驗(yàn)(Point-of-care testing，POCT)是設(shè)備小、移動(dòng)方便、操作簡(jiǎn)單、出結(jié)果時(shí)間短、即時(shí)即地檢測(cè)的檢測(cè)方式[8]。熒光微球免疫層析技術(shù)檢測(cè)病毒時(shí)有較高的效率和靈敏度，可以定量檢測(cè)，而且沒有較高的技術(shù)要求。該技術(shù)在農(nóng)業(yè)上可以運(yùn)用于微生物鑒定、霉菌毒素殘留測(cè)定、藥物殘留鑒定、動(dòng)物疾病診斷、食品質(zhì)量檢測(cè)等[9]。

本研究用制備的鼠源多克隆抗體偶聯(lián)熒光微球，用兔源多克隆抗體作為檢測(cè)線(Test line, T線)，山羊抗鼠IgG抗體為質(zhì)控線(Control line, C線)[10]，以FAdV-4具有特異性的抗原決定簇Hexon蛋白制備多克隆抗體，建立FAdV-4熒光微球免疫層析試紙條檢測(cè)方法，并驗(yàn)證該試紙條的特異性和靈敏性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 原核表達(dá)載體 pGEX-6p-1、pET-32a、FAdV-4 基因組DNA、FAdV-4病毒液(滴度1 ml 1×107.52TCID50)，F(xiàn)AdV-4 陽(yáng)性臨床樣本、禽白血病(ALV)陽(yáng)性臨床樣本，均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 7只BALB/c 小鼠、2只2 kg 左右的新西蘭雌兔。

1.1.3 主要試劑 洗脫液Ⅰ：120.00 g尿素、1 ml tritan100、2.92 g氯化鈉、0.05 g EDTA，加入磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffered saline, PBS)至體積為1 L。洗脫液Ⅱ：120 g尿素、1 ml tritan100，加入PBS至體積為1 L。Premix Taq?Version 2.0(Loading dye mix)、5×Protein SDS PAGE Loading Buffer、2×Power Taq PCR MasterMix均購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司，DH5α chemically competent cell、Cat no. 11802ES購(gòu)自北京全式金生物公司，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、PAGE 凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購(gòu)自合肥艾格博斯生物科技有限公司，熒光微球購(gòu)自美國(guó)Bangs Laboratories, Inc公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的合成 參考GenBank(登錄號(hào)MN781665)的FAdV-4hexon基因堿基序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物hexon-F/hexon-R，以實(shí)驗(yàn)保存的FAdV-4基因組DNA為模板，擴(kuò)增目的基因片段。用實(shí)驗(yàn)室保存的線性化載體pET-32a及pGEX-6p，分別設(shè)計(jì)載體引物pET-32a-hexon-F/pET-32a-hexon-R和pGEX-6p-1-hexon-F/pGEX-6p-1-hexon-R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 本研究使用的引物

1.2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 以實(shí)驗(yàn)室保存的FAdV-4基因組 DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段(729 bp)。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃ 變性30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃復(fù)性 2 min，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將重組產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，經(jīng)過純化后，與保存的線性化載體利用PCR進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。提取陽(yáng)性質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，將結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品于-20 ℃保存，作為后續(xù)試驗(yàn)的陽(yáng)性模板。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)條件確立 將His-hexon蛋白和GST-hexon蛋白分別接種于LB培養(yǎng)基，用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，IPTG 終濃度設(shè)為0.25 mmol/L及0.50 mmol/L，誘導(dǎo)溫度分別設(shè)為 16 ℃、28 ℃ 及 37 ℃。誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffered saline, PBS)重懸沉淀。采用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎蛋白質(zhì)沉淀，收集蛋白質(zhì)上清液與包涵體沉淀，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳后，確定融合蛋白質(zhì)的表達(dá)條件。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物溶解純化條件的確立 先用PBS 重懸包涵體沉淀，離心10 min，棄上清液。分別用洗脫液Ⅰ、洗脫液Ⅱ和8 mol/L尿素重懸His-hexon蛋白沉淀，混勻，冰上靜置10 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液。分別用洗脫液Ⅰ、洗脫液Ⅱ、6 mol/L尿素重懸GST-hexon蛋白沉淀，混勻，冰上靜置10 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液。分別取經(jīng)處理后的His-hexon蛋白和GST-hexon蛋白上清液，SDS-PAGE驗(yàn)證，確定融合蛋白的溶解條件。

1.2.5 動(dòng)物免疫及抗體效價(jià)的測(cè)定 用BCA試劑盒測(cè)定His-hexon蛋白和GST-hexon 蛋白的濃度。用PBS稀釋重組抗原，首次免疫動(dòng)物時(shí)，抗原溶液與弗氏完全佐劑等量混合制成乳劑后免疫動(dòng)物，之后免疫時(shí)，抗原溶液與弗氏不完全佐劑等量混合，振蕩使之完全融合。具體的免疫過程：取已經(jīng)乳化好的His-hexon蛋白，皮下分多點(diǎn)注射7只BALB/c小鼠。2周、4周、6周后以相同方法再各免疫1次，最后一次免疫后4 d摘除小鼠眼球取血。取GST-hexon 蛋白注射新西蘭大白兔2只，每隔7 d進(jìn)行一次免疫，最后一次免疫后4 d采集心臟血液。收集血清，經(jīng)過洗滌、封閉，加入不同濃度的多克隆抗血清，孵育1 h。加入待測(cè)血清，加入用封閉液按1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體，孵育1 h，避光，用3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine, TMB)顯色，終止后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光值，計(jì)算分析P/N值(陽(yáng)性血清與陰性血清OD值之比)確定融合蛋白最佳包被濃度，根據(jù)最佳包被濃度測(cè)定抗體效價(jià)。用相同的方法測(cè)定兔源多克隆抗體效價(jià)。

1.2.6hexon基因的多克隆抗體Western Blot鑒定 GST-hexon蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉后4 ℃過夜。以稀釋100倍的鼠源多克隆抗體為一抗，稀釋5 000 倍的HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗，潤(rùn)洗后，加ECL顯色液避光顯色。His-hexon經(jīng)12% SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印到PVDF膜，過夜孵育，以稀釋100倍的兔源多克隆抗體為一抗，稀釋5 000倍的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，加ECL顯色液，避光顯色。拍照分析。

1.3 FAdV-4 POCT熒光微球免疫層析方法的建立

1.3.1 POCT 試紙條包被微球液最適pH的確定 將標(biāo)準(zhǔn)品用PBS 2倍梯度稀釋，空白對(duì)照為PBS。FAdV-4病毒液的每個(gè)樣品分別用pH值為6.2、6.6、7.2 偶聯(lián)鼠源多克隆抗體組裝的試紙條檢測(cè)，在電腦上讀出數(shù)值。

1.3.2 POCT試紙條包劃線濃度的確定 將標(biāo)準(zhǔn)品用PBS 2倍梯度稀釋，空白對(duì)照為PBS。將FAdV-4病毒液的每個(gè)樣品分別用劃線稀釋液稀釋至1 g/L、2 g/L、3 g/L組裝的試紙條檢測(cè)，讀出數(shù)值。

1.3.3 敏感性試驗(yàn) 在最適pH下稀釋5倍微球稀釋液，利用三維噴點(diǎn)平臺(tái)將稀釋好的抗體標(biāo)記微球溶液噴涂到5 mm的玻璃纖維膜與最佳劃線濃度制備好的PVC板。分別取 FAdV-4 病毒液(分別稀釋 101、102、103、104倍)、禽白血病臨床陽(yáng)性樣本及樣本稀釋液加入加樣孔，用本研究建立的POCT熒光微球免疫層析方法進(jìn)行檢測(cè)，15 min后進(jìn)行讀數(shù)，保存數(shù)據(jù)。

1.4 臨床樣品的檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)室保存的7份禽腺病毒樣本分別進(jìn)行 PCR檢測(cè)與POCT熒光微球免疫層析檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-32a-hexon及pGEX-6p-1-hexon載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物與載體pET-32a用同源重組方法連接，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒。進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示，PCR目的片段大小在729 bp左右，與預(yù)期相符，測(cè)序正確。PCR產(chǎn)物與載體pGEX-6p-1經(jīng)同源重組方法連接，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，PCR目的片段與預(yù)期相符，測(cè)序正確。

M：核酸大小標(biāo)準(zhǔn)；1、2：PCR產(chǎn)物。

M：核酸大小標(biāo)準(zhǔn)；1、2：PCR產(chǎn)物。

2.2 產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)溫度及IPTG濃度的確定

His-hexon蛋白在不同濃度IPTG、不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，His-hexon蛋白在包涵體中表達(dá)，在蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量4.3×104左右出現(xiàn)目的條帶，第5孔融合蛋白目的條帶明顯(圖3)。因此在16 ℃、 IPTG濃度0.25 mmol/L條件下誘導(dǎo)表達(dá)His-hexon融合蛋白最佳。

M為蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1、2分別為16 ℃誘導(dǎo)溫度下空載未誘導(dǎo)、空載誘導(dǎo)，3為16 ℃誘導(dǎo)溫度下菌液未誘導(dǎo)，4～6分別為16 ℃誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度0.25 mmol/L下的菌液、上清液、包涵體，7～9分別為16 ℃誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度0.50 mmol/L下的菌液、上清液、包涵體。

GST-hexon蛋白在不同濃度IPTG、不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，GST-hexon蛋白在包涵體中表達(dá)，在蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量5.2×104左右出現(xiàn)目的條帶，第9孔融合蛋白目的條帶明顯且雜蛋白質(zhì)最少。所以在37 ℃、 IPTG濃度0.50 mmol/L 條件下誘導(dǎo)表達(dá)GST-hexon融合蛋白最佳(圖4)。

M為蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1、2分別為16 ℃誘導(dǎo)溫度下空載未誘導(dǎo)、空載誘導(dǎo)；3為16 ℃誘導(dǎo)溫度下菌液未誘導(dǎo)，4～6分別為16 ℃誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度0.50 mmol/L下的菌液、上清液、包涵體，7～9分別為37 ℃誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度0.50 mmol/L下的菌液、上清液、包涵體。

2.3 融合蛋白的溶解純化條件優(yōu)化

His-hexon蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式存在。對(duì)重懸沉淀混合后溶解純化的His-hexon蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分析，從圖5可看出，8 mol/L尿素能充分溶解His-hexon蛋白且目的蛋白濃度較高。

M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：洗脫液Ⅰ；2：洗脫液Ⅱ；3：8 mol/L尿素。

對(duì)經(jīng)洗脫液、尿素洗脫下來的GST-hexon蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，從圖6可看出，6 mol/L尿素能充分溶解GST-hexon蛋白且目的蛋白濃度較高。

M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：洗脫液Ⅰ；2：洗液Ⅱ；3：6 mol/L尿素；4：8 mol/L尿素；5：細(xì)菌菌液。

2.4 Hexon基因的多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法測(cè)定最后一次免疫后小鼠血清。在 1∶800包被抗原稀釋倍數(shù)下，P/N值普遍高于1∶400與1∶1 600包被濃度下的P/N值，并且在抗原稀釋到1∶800、血清稀釋到1∶100時(shí)P/N值達(dá)到最高，所以在1∶800稀釋度下包被效果最佳。在包被濃度1∶800下進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，再用間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，取P/N≥2.1的血清稀釋度為小鼠血清效價(jià)，結(jié)果(表2)顯示小鼠血清效價(jià)為1∶819 200。

表2 鼠源抗體效價(jià)的間接ELISA測(cè)定結(jié)果

用間接ELISA方法檢測(cè)最后一次免疫后新西蘭大白兔的血清，在包被濃度1∶800 時(shí)P/N值普遍高于1∶400與1∶1 600包被濃度下的P/N值，且在抗原稀釋到1∶800、血清稀釋到1∶800時(shí)P/N值達(dá)到最高，所以在1∶800稀釋度下包被效果最佳。在包被濃度1∶800時(shí)進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，再用間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，取P/N≥2.1的血清稀釋度為兔血清效價(jià)，結(jié)果(表3)顯示，1號(hào)兔的血清效價(jià)為1∶512 00、2號(hào)兔血清效價(jià)為1∶102 400。

表3 兔源抗體效價(jià)的間接ELISA測(cè)定結(jié)果

2.5 多克隆抗體Western Blot鑒定

將GST-hexon蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定，結(jié)果(圖7)顯示第2孔在5.2×104左右出現(xiàn)與預(yù)期蛋白質(zhì)大小相同的條帶。將His-hexon融合蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定，結(jié)果(圖8)顯示第2 孔在4.3×104左右出現(xiàn)與預(yù)期蛋白質(zhì)大小相同的條帶。

1：pGEX-6p-1空載菌液；2：GST-hexon蛋白。

1：pET-32a空載菌液；2：pET-32a-hexon。

2.6 POCT試紙條包被微球液最適pH的優(yōu)化及劃線濃度的確定

用FAdV-4病毒液作為標(biāo)準(zhǔn)品鑒定試紙條包被微球液最適pH。采用熒光讀數(shù)儀讀取T線(檢測(cè)線)和C線(質(zhì)控線)的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算T/C值。T/C值越大說明特異性越好，如表4所示，該鼠源多克隆抗體熒光包被微球液在pH為6.6時(shí)效果最好。

表4 不同包被微球液pH下POCT試紙條熒光強(qiáng)度峰值

2.7 POCT試紙條劃線質(zhì)量濃度的優(yōu)化

用FAdV-4病毒液作為標(biāo)準(zhǔn)品，比較試紙條包被微球液最適的兔源多克隆抗體T線劃線質(zhì)量濃度。用熒光讀數(shù)儀讀取的T線和C線熒光強(qiáng)度，并計(jì)算T/C值。T/C值越大說明特異性越好，如表5所示，兔源多克隆抗體T線劃線質(zhì)量濃度在3 g/L時(shí)效果最好。

表5 不同兔源抗體質(zhì)量濃度下POCT試紙條熒光峰值

2.8 POCT熒光微球免疫層析檢測(cè)的敏感性

用POCT試紙條檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存的臨床樣本，分別檢測(cè)了3組PBS稀釋液、3組ALV陽(yáng)性組織研磨液、3組FAdV-4陽(yáng)性組織研磨液與5組FAdV-4病毒液。結(jié)果(表6)顯示ALV陽(yáng)性組織研磨液為陰性，F(xiàn)AdV-4陽(yáng)性組織稀釋液為陽(yáng)性。FAdV-4病毒液的稀釋度1×103時(shí)為陽(yáng)性，稀釋度1×104時(shí)為陰性，禽白血病陽(yáng)性組織液為陰性。檢測(cè)病毒液最低病毒滴度為1 ml 1×104.52TCID50。

2.9 POCT熒光微球免疫層析檢測(cè)方法初步應(yīng)用

取實(shí)驗(yàn)室保存的7份禽腺病毒樣本用POCT熒光微球免疫層析試紙條檢測(cè)。POCT熒光微球免疫層析試紙條15 min檢測(cè)出結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，檢測(cè)出2份陽(yáng)性，與PCR檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷結(jié)果相符。

圖9 POCT熒光微球免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果圖

3 討論

禽腺病毒屬于禽腺病毒屬，是DNA病毒[11-13]。禽腺病毒有12 種血清型(FAdV-1～FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9～FAdV-11)[14]。FAdV-4和FAdV-8b兩種血清型最常見，F(xiàn)AdV-4型在中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)中發(fā)生更加普遍，引起了廣泛重視[15]。血清4型禽腺病毒會(huì)引起雞的包涵體肝炎、心包積水綜合征、產(chǎn)蛋下降綜合征等臨床癥狀，發(fā)病率和死亡率都很高[16]。目前對(duì)于血清4型禽腺病毒最常見的檢測(cè)法有瓊脂試驗(yàn)檢測(cè)法、中和試驗(yàn)檢測(cè)法、ELISA檢測(cè)法、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)法等，這些檢測(cè)方法都能有效地檢測(cè)病毒，具有良好的特異性[17]，但是操作專業(yè)性強(qiáng)，需要在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)工作者來說是比較困難的。因此建立操作要求低且適用于大部分養(yǎng)殖場(chǎng)和基層獸醫(yī)臨床的檢測(cè)方法十分必要。

本研究針對(duì)血清4型禽腺病毒特異性抗原的多克隆抗體，建立了一種檢測(cè)血清4型禽腺病毒的POCT熒光微球免疫層析試紙條檢測(cè)方法。生產(chǎn)POCT熒光微球免疫層析試紙條的關(guān)鍵技術(shù)在于抗體的制備，用特異性高的抗體制備的試紙條特異性和靈敏性也更高[18]。利用同源重組技術(shù)將目的基因與載體連接，轉(zhuǎn)化為His-hexon和GST-hexon，作為免疫原，制備高效價(jià)的多克隆抗體，用間接ELISA和Western Blotting方法鑒定。本試驗(yàn)用的是多克隆抗體，利用ProteinA/G-Sephrose FF親和層析柱快速提取多抗中的IgG，大大提高了試紙條的特異性，捕獲到了抗原的存在，但靈敏度還有待進(jìn)一步提高[19]。

影響試紙條特異性與靈敏性的因素還有一些化學(xué)藥劑造成的非特異性結(jié)合、包被液和稀釋液的濃度、包被液的pH等。不同樣本稀釋液檢測(cè)的結(jié)果會(huì)有一定的差異，一般會(huì)選擇PBS。在試紙條組裝過程中，要避免操作臺(tái)不被病原等可控因素影響，組裝時(shí)盡可能不觸碰到結(jié)合墊與NC膜，避免出現(xiàn)誤差[20]。本試紙條最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要昂貴的儀器，定性檢測(cè)的時(shí)候只需要紫外燈光照射便可觀察結(jié)果，既快速又簡(jiǎn)單[21]，可以在15 min內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果，適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。但還需要進(jìn)一步完善和優(yōu)化生產(chǎn)過程，以適應(yīng)不斷變化的檢測(cè)需求。

熒光微球制備過程簡(jiǎn)單且受外界環(huán)境的干擾較小，穩(wěn)定性更好，利用檢測(cè)儀就能實(shí)現(xiàn)基本定量，同時(shí)POCT技術(shù)已是很多病毒檢測(cè)項(xiàng)目的研究熱點(diǎn)[22]。本試驗(yàn)將二者相結(jié)合，建立了血清4型禽腺病毒的POCT熒光微球免疫層析檢測(cè)方法，為基層獸醫(yī)臨床診斷提供了一種新的快速檢測(cè)方法。