高文昊, 杜露平, 侯立婷, 于曉明, 陳 瑾, 馮秀麗, 鄭其升, 程海衛(wèi)

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/江蘇省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京210095；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州225009)

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)作為專職抗原遞呈細(xì)胞,可以借助其表面不同的受體進(jìn)行抗原的捕獲、加工與遞呈,從而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。1995年,Witmer-Pack等發(fā)現(xiàn)了小鼠DC細(xì)胞表面的一種特異性的抗原遞呈受體——CD205[1]。CD205屬于C型凝集素受體中的巨噬細(xì)胞甘露糖受體家族,又稱為DEC-205或Ly75[2],在組織中分布廣泛,高度表達(dá)于DC細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞,在B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)較少或幾乎不表達(dá)[3]。CD205是目前在機(jī)體淋巴器官T細(xì)胞區(qū)域的DC細(xì)胞中表達(dá)最廣泛的唯一受體[4],參與抗原遞呈過程并起到關(guān)鍵作用。研究結(jié)果顯示,與非靶向抗原相比較,CD205靶向可以使OVA抗原遞呈效率提高至少100倍,抗原用量減少近1 000倍[5]。通過將乙肝病毒preS抗原靶向至CD205,可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高效的IgG1和IgG2a抗體反應(yīng),對(duì)乙肝病毒感染產(chǎn)生預(yù)防和治療效果[6-8]。上述研究結(jié)果顯示,CD205靶向可以減少抗原用量,誘導(dǎo)高效的免疫應(yīng)答,在抗病毒感染方面具有良好的發(fā)展?jié)摿?已成為新型疫苗制劑研發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。

CD205靶向在獸醫(yī)領(lǐng)域研究日益受到關(guān)注,但其效應(yīng)機(jī)制尚不清楚。本研究擬選擇豬CD205分子為研究對(duì)象,結(jié)合原核表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)勢(shì)[9],針對(duì)編碼豬CD205的N端胞外區(qū)的CysR-FNⅡ截短基因片段進(jìn)行克隆表達(dá)及蛋白質(zhì)純化,制備多克隆抗體,并對(duì)其功能進(jìn)行鑒定,驗(yàn)證本研究所獲得的重組蛋白的生物學(xué)活性,為豬CD205特異性抗體的研制及豬CD205抗原靶向研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6～8周齡ICR系清潔級(jí)雌性小鼠購于南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒均為捷瑞公司的產(chǎn)品,熒光抗體(Anti-mouse-IgG FITC,anti-pig-CD1 APC)購于上海優(yōu)寧維公司。大腸桿菌BL21、DH5α和pET-32a質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。根據(jù)NCBI上公布的編碼豬CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因(GenBank:GQ420669.1)設(shè)計(jì)PCR引物(表1),由上海生工生物有限公司合成。

表1 本研究用引物對(duì)序列

1.2 pET-32a-CysR-FN Ⅱ重組質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白質(zhì)表達(dá)

1.2.1 豬淋巴總RNA的提取和cDNA的合成 取豬新鮮的淋巴結(jié),運(yùn)用Trizol法按照說明書操作提取RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。

1.2.2CysR-FNⅡ截短基因的擴(kuò)增及鑒定 以合成cDNA為模板,使用引物205R和205F,PCR擴(kuò)增CysR-FNⅡ截短基因。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,54.5 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定,對(duì)目的條帶進(jìn)行純化回收。將回收產(chǎn)物與 pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑選單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 添加酶切位點(diǎn) 利用方法1.2.2所述陽性克隆為模板,使用引物205M-R和205M-F,通過PCR擴(kuò)增在CysR-FNⅡ截短基因的兩端添加酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。之后鑒定步驟同方法1.2.2。

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分別對(duì)方法1.2.3所述陽性克隆質(zhì)粒和pET-32a質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定,利用試劑盒進(jìn)行純化和回收。經(jīng)過夜連接后,轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,通過菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定,陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.5 重組蛋白的表達(dá)及純化 利用方法1.2.4所述陽性克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中(含0.1%氨芐青霉素),37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),23 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。之后,離心收集菌體,并使用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓破碎,分別利用SDS-PAGE和Western Blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。使用Ni2+親和層析柱純化,并進(jìn)行鑒定。

1.3 CysR-FN Ⅱ多克隆抗體的制備與功能鑒定

1.3.1 小鼠免疫 使用純化后的目的蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,每只小鼠皮下免疫注射50 μg。注射后第14 d采血并收集血清。

1.3.2 抗體效價(jià)測(cè)定 利用純化后的目的蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板,將免疫后血清倍比稀釋,使用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗,檢測(cè)免疫后14 d血清中CysR-FN Ⅱ抗體水平。

1.3.3 豬骨髓來源樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 參考Carrasco等的方法[10]誘導(dǎo)分化豬骨髓來源樹突狀細(xì)胞(Bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)。取新鮮的豬胸骨,使用PBS沖洗豬胸骨得到細(xì)胞懸液。裂解紅細(xì)胞后,使用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque獲得淋巴細(xì)胞懸液,在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和50 μmol/L 2-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。使用25 ng/ml重組豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化,之后隔日半量換液,持續(xù)培養(yǎng)至第7 d,收獲細(xì)胞。

1.3.4 間接免疫熒光法鑒定 將方法1.3.3所獲得的新鮮豬BMDC培養(yǎng)于細(xì)胞爬片上,待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí),取出爬片并用PBS漂洗。之后添加4%多聚甲醛固定15 min,使用1%Triton室溫透化5 min,PBS漂洗。分別使用免疫前血清和免疫后血清與豬BMDC細(xì)胞37 ℃孵育1 h。依次使用anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC、DAPI染色,用激光共聚焦顯微鏡(PerkinElmer公司)觀察。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)分析 取方法1.3.3所獲得的新鮮豬BMDC(1 ml 1×106)于2支1.5 ml無菌離心管中,1支依次利用免前血清、anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC進(jìn)行染色,另1支依次用免后血清、anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC染色。利用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)兩組豬BMDC中鼠IgG與豬CD1雙陽性(Mouse-IgG+CD1+)的數(shù)量,比較免疫前血清和免疫后血清孵育后豬DC細(xì)胞的特異性熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 CysR-FN Ⅱ基因的擴(kuò)增及鑒定

以cDNA為模板,根據(jù)編碼豬CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示,泳道1在500 bp與750 bp之間出現(xiàn)目的基因條帶,大小與預(yù)期相符合。同時(shí)測(cè)序分析結(jié)果顯示序列正確,無突變。

2.2 CysR-FN Ⅱ基因酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增及鑒定

利用獲得的CysR-FNⅡ目的基因作為模板,并設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ和HindⅢ的引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示,泳道2在500 bp與750 bp之間出現(xiàn)目的基因條帶,大小與預(yù)期相符合。同時(shí)測(cè)序分析結(jié)果顯示序列正確,無突變。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CysR-FN Ⅱ的構(gòu)建與鑒定

分別利用BamH Ⅰ和HindⅢ對(duì)pMD-18T-CysR-FNⅡ質(zhì)粒和pET-32a質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示,酶切處理前后的pMD-18T-CysR-FNⅡ片段大小與預(yù)期結(jié)果一致?；厥漳康臈l帶,并與pET-32a質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CysR-FNⅡ,轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定,結(jié)果如圖1所示,酶切處理前后的pET-32a-CysR-FNⅡ片段大小,與預(yù)期結(jié)果一致。所獲得的陽性克隆測(cè)序結(jié)果正確。

M1:DL2000 DNA marker,從上至下條帶依次為2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；泳道1：經(jīng)PCR擴(kuò)增的編碼豬CD205分子的CysR-FN Ⅱ截短基因；泳道2：CysR-FN Ⅱ酶切位點(diǎn)的鑒定；泳道M2: DL10000 DNA marker,從上至下條帶依次為10 000 bp、7 000 bp、4 000 bp、2 000 bp、1 000 bp、500 bp、250 bp；泳道3: 未經(jīng)酶切處理的重組質(zhì)粒pMD-18T-CysR-FN Ⅱ；泳道4：雙酶切重組質(zhì)粒pMD-18T-CysR-FN Ⅱ的產(chǎn)物；泳道5：未經(jīng)酶切處理的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CysR-FN Ⅱ；泳道6：雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CysR-FN Ⅱ的產(chǎn)物。

2.4 目的蛋白的可溶性表達(dá)與鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CysR-FNⅡ經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)后,收集菌體進(jìn)行高壓破碎,并收集破碎后的樣品。分別用誘導(dǎo)前的全菌樣品、誘導(dǎo)后的全菌樣品、破碎后的上清液樣品以及破碎后的沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE與Western Blot鑒定。結(jié)果如圖2A所示,誘導(dǎo)后的全菌樣品(泳道2)以及破碎后的上清液樣品(泳道3)均在相對(duì)分子質(zhì)量4.0×104左右出現(xiàn)目的條帶,相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期結(jié)果一致,且為可溶性表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果如圖2B所示,誘導(dǎo)后的全菌樣品(泳道2)以及破碎后的上清液樣品(泳道3)在約4.0×104處檢測(cè)到目的條帶。

2.5 重組蛋白CysR-FN Ⅱ的純化

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CysR-FNⅡ表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過多次純化和SDS-PAGE鑒定,摸索出最適合的純化條件,即洗脫液含50 mmol/L咪唑時(shí)雜蛋白去除效率最高,且目的蛋白損失較少。純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot鑒定,結(jié)果如圖2A、2B所示,泳道5在4.0×104左右出現(xiàn)單一的目的條帶,純度估計(jì)在90%以上。

A圖為SDS-PAGE鑒定重組蛋白CysR-FN Ⅱ表達(dá)及純化結(jié)果,其中泳道M為蛋白質(zhì)Marker,從上至下10條條帶相對(duì)分子質(zhì)量依次為2.50×105、1.50×105、1.00×105、7.0×104、5.0×104、4.0×104、3.5×104、2.5×104、2.0×104、1.5×104；B圖為Western Blot鑒定重組蛋白CysR-FN Ⅱ表達(dá)及純化結(jié)果,其中泳道M為蛋白質(zhì)Marker,從上至下3條條帶相對(duì)分子質(zhì)量依次為5.0×104、4.0×104、3.5×104。泳道1：誘導(dǎo)前的全菌樣品；泳道2：誘導(dǎo)后的全菌樣品；泳道3：滲導(dǎo)后的全菌破碎后的上清液樣品；泳道4：誘導(dǎo)后的全菌破碎后的沉淀樣品；泳道5：滲導(dǎo)后的全菌純化后的目的蛋白樣品。

2.6 重組蛋白CysR-FN Ⅱ免疫小鼠血清抗體檢測(cè)

免疫注射后第14 d,采用間接ELISA方法,對(duì)血清中抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示,血清倍比稀釋至1∶6 400時(shí),OD450數(shù)值僅為0.052,與陰性血清相比,P/N<1.5,判定為陰性,即抗體效價(jià)為1∶3 200。

圖3 重組蛋白CysR-FN Ⅱ免疫小鼠14 d后抗體效價(jià)測(cè)定

2.7 間接免疫熒光鑒定CysR-FN Ⅱ多克隆抗體與豬BMDC的共定位特性

利用獲得的新鮮豬BMDC,制作細(xì)胞爬片,分別與免前血清、免后血清進(jìn)行孵育。PBS漂洗后依次使用anti-mouse-IgG FITC、anti-pig-CD1 APC、DAPI染色,激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖4所示,免疫前血清試驗(yàn)組中未觀察到綠色熒光,免疫后血清試驗(yàn)組中在胞膜及胞質(zhì)中可見綠色熒光,且與APC所標(biāo)記的紅色熒光共定位,該結(jié)果表明本試驗(yàn)所獲得的CD205多克隆抗體可以與豬BMDC發(fā)生特異性結(jié)合。

A組為免疫前血清實(shí)驗(yàn)組;B組為免疫后血清實(shí)驗(yàn)組。分別使用anti-mouse-IgG FITC；DAPI和anti-pig-CD1 APC進(jìn)行標(biāo)記。

2.8 流式細(xì)胞分析CysR-FN Ⅱ多克隆抗體與豬BMDC結(jié)合特性

利用獲得的新鮮豬BMDC,分別與免疫前血清、免疫后血清進(jìn)行孵育,使用熒光抗體標(biāo)記后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)豬BMDC的mouse-IgG+CD1+數(shù)。結(jié)果如圖5所示,左側(cè)曲線代表免疫前血清實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到的綠色熒光強(qiáng)度，右側(cè)曲線代表免疫后血清實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到的綠色熒光強(qiáng)度，免疫后血清的綠色熒光強(qiáng)度與免疫前相比明顯增強(qiáng),表明本試驗(yàn)所獲得的多克隆抗體可以與豬BMDC發(fā)生特異性結(jié)合。

圖中左側(cè)實(shí)線表示免疫前血清實(shí)驗(yàn)組流式檢測(cè)FITC通道熒光強(qiáng)度，右側(cè)實(shí)線表示免疫后血清實(shí)驗(yàn)組流式檢測(cè)FITC通道熒光強(qiáng)度。

3 討論

CD205作為首個(gè)報(bào)道的DC細(xì)胞特異性抗原遞呈受體,是在機(jī)體淋巴器官T細(xì)胞區(qū)域的DC細(xì)胞中表達(dá)最廣泛的唯一受體,在抗原遞呈過程中具有關(guān)鍵作用[11-12]。CD205作為抗原靶向的研究熱點(diǎn),已經(jīng)在多種病毒的疫苗設(shè)計(jì)中被研究[13-14]。同時(shí)針對(duì)免疫耐受的現(xiàn)象,可以通過CD205靶向抗體的作用,增強(qiáng)抗原的遞呈,激活DC細(xì)胞,進(jìn)而誘導(dǎo)出病毒特異性的免疫反應(yīng)[15]。截至目前,多個(gè)CD205靶向人用疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[6-7]。CD205靶向在獸醫(yī)領(lǐng)域研究日益受到關(guān)注,但其效應(yīng)機(jī)制尚不清楚,而關(guān)于CD205靶標(biāo)蛋白的制備,均是利用真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)制備,表達(dá)產(chǎn)物雖具有一定的生物學(xué)活性,但產(chǎn)量較低,耗時(shí)費(fèi)力[16-18]。

本試驗(yàn)擬利用原核系統(tǒng)表達(dá)編碼豬CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因,所制備的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和 Western Blot鑒定,均以可溶性形式表達(dá),且相對(duì)分子質(zhì)量與理論值一致。使用純化后的蛋白質(zhì)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,免疫后14 d抗體效價(jià)達(dá)1∶3 200。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞分析結(jié)果均表明本試驗(yàn)所制備的多克隆抗體可以與豬BMDC發(fā)生特異性結(jié)合,即本試驗(yàn)所制備的目的蛋白具有一定的生物學(xué)活性。后續(xù)研究將利用所制備的CysR-FN Ⅱ目的蛋白,制備豬CD205特異性抗體,為研究豬CD205抗原靶向奠定基礎(chǔ),并對(duì)CD205介導(dǎo)抗原靶向遞呈的作用機(jī)理進(jìn)行研究,為新型疫苗設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。