高曉曉， 涂麗琴， 孫 楓， 李 碩， 崔曉艷， 陳 新， 章松柏， 季英華

(1.農林病蟲害預警與調控湖北省工程技術研究中心/長江大學，湖北荊州434025；2.江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇南京210014；3.江蘇省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，江蘇南京210014)

蠶豆(ViciafabaL.)是豆科野碗豆屬的一個栽培種，屬于一年生或兩年生豆科植物。蠶豆是重要的冬季食用豆作物，富含蛋白質、氨基酸、微量元素、碳水化合物和維生素等營養(yǎng)成分；其用途廣泛，可用于食品加工和養(yǎng)殖業(yè)飼料生產，屬于重要的經(jīng)濟增收作物。中國蠶豆種植面積以及產量均位居世界首位[1]。但近年來在蠶豆生產過程中，病毒病發(fā)生種類呈現(xiàn)多樣化態(tài)勢，同時其造成的危害也有加重趨勢，導致蠶豆產量減少和品質下降[2]。目前報道的侵染蠶豆的病毒主要有三葉草黃脈病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV)、蠶豆染色病毒(Broad bean stain virus, BBSV)、菜豆黃花葉病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)及蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)等類型[3]。病毒種類的多樣化給蠶豆病毒病的高效防控提出了極大的挑戰(zhàn)。

三葉草黃脈病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV)屬于馬鈴薯Y病毒科Y病毒屬成員，主要侵染菜豆[4]、豌豆、蠶豆和扁豆[5]等多種豆科植物及一些觀賞植物[6-7]。發(fā)病植株往往表現(xiàn)出頂部枯死、葉脈壞死和葉片脫落，同時豆莢變形壞死、發(fā)育遲緩[8]，嚴重時可引起植株全身扭曲變形并系統(tǒng)性壞死，極大地影響生產效益，給農戶帶來經(jīng)濟損失[9]。ClYVV最早由英國學者Hollings和Nariani從白三葉草中發(fā)現(xiàn)并分離[10]，之后西班牙[11]、美國[12]、澳大利亞[13]、韓國[14]等國的學者陸續(xù)地報道了該病毒對本國植物的危害。目前中國關于ClYVV的報道與研究相對較少。1989年，李長松等[4]從山東泰安菜豆病樣中利用血清學方法檢測到三葉草黃脈病毒。張趁華等[15]開展了侵染蠶豆ClYVV的鑒定與研究。

2018年，課題組在對江蘇省蠶豆病毒病調查過程中，發(fā)現(xiàn)鹽城蠶豆上出現(xiàn)疑似ClYVV危害的癥狀。為進一步確認該病害的病原體隸屬的病毒種類并明確其全基因組結構特征，本研究擬利用分子手段對其進行鑒定，并通過分段擴增的方法獲得ClYVV江蘇蠶豆分離物全基因組序列，分析其基因組結構特征，明確其分類地位，為進一步研究ClYVV的致病機制與制定防控策略奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

供試樣品為2018年采集于江蘇省鹽城市蠶豆樣品[16]，經(jīng)液氮冷凍后，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試劑

RANiso Reagent、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、PrimeSTARTMMAX、pMD18-T購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；TreliefTM5α大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京擎科生物公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司。

1.3 RNA提取

參照吳淑華等[17]的方法，利用Trizol法提取蠶豆樣品總RNA，提取后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR及ClYVV全基因克隆

以蠶豆疑似病樣總RNA為模板，參照涂麗琴等[16]的方法進行反轉錄。針對已報道的ClYVV全序列設計5對分段引物(表1)，以cDNA為模板，分別擴增5段序列。PCR反應總體系40 μl: PrimeSTAR MAX 20 μl, F、R引物各2 μl，ddH2O 14 μl, cDNA 2 μl。擴增條件為94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，重復34個循環(huán)；72 ℃ 5 min，12 ℃ 10 min。擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Axygen試劑盒割膠回收后，連接至pMD18-T載體。利用熱激法轉化TreliefTM5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR檢測與酶切驗證后將陽性克隆送至安徽通用生物公司進行序列測定。

表1 ClYVV基因片段擴增引物

1.5 ClYVV全基因序列分析

根據(jù)測序結果，將獲得的5個片段序列進行拼接，利用DNAstar、Snap Gene、BioEdit、Clustal X等軟件與NCBI上已公布的ClYVV 全基因序列進行基因組結構特征及多重序列比對分析，并利用BLAST網(wǎng)站進行同源性分析。利用MEGA7軟件的鄰接法(Neighbor-joining Algorithm)進行聚類分析以及系統(tǒng)進化樹的構建，進化樹的可信度使用1 000次自導復制驗證。

2 結果與分析

2.1 病樣田間采集及ClYVV檢測

2018年，田間調查發(fā)現(xiàn)，鹽城部分田塊蠶豆植株葉片上卷皺縮、比較僵硬，同時會伴有壞死斑點，部分植株伴有褪綠等疑似病毒感染的癥狀(圖1)。田間疑似病樣采集后進行分子檢測。在利用ClYVV特異性檢測引物(ClYVV-CP-F和ClYVV-CP-R，表1)進行擴增時，發(fā)現(xiàn)從鹽城市采集的33份樣品中有19份能擴增到特異的目的片段(圖1)。進一步測序驗證后確認檢測到的病毒為ClYVV，說明當?shù)匦Q豆上存在ClYVV的侵染危害。

A:健康蠶豆植株;B:發(fā)病蠶豆植株;C:鹽城蠶豆陽性樣品ClYVV特異性擴增圖譜。M:DL 5000 marker;CK:陰性對照;a～s:鹽城蠶豆陽性樣品JS-1～JS-19。

2.2 ClYVV全基因組分段克隆

ClYVV基因組全長約9～10 kb，本研究采用分段擴增的策略(圖2)，設計5對針對ClYVV全基因序列的特異性引物(表1)，利用蠶豆病樣總RNA為模板反轉錄得到的cDNA分別進行PCR擴增。產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結果5對引物均擴增到與目的大小相同的條帶(圖3a)。回收目的條帶后，16 ℃連接pMD18-T載體，熱激法轉化TreliefTM5α大腸桿菌感受態(tài)細胞。經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆后，再經(jīng)酶切驗證(圖3b)后送至安徽通用生物公司進行序列測定。

圖2 ClYVV分段克隆策略

M：Marker DL 5000 marker; Cl1～Cl5: ClYVV5個基因片段。

2.3 ClYVV江蘇蠶豆分離物基因組特征分析

克隆片段序列測定后，基于重疊序列進行拼接獲得完整ClYVV江蘇蠶豆分離物(ClYVV-JS)全基因序列，并發(fā)布于NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為OP296252。ClYVV-JS基因組全長9 585 bp，編碼區(qū)可分為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、6K2、CI、VPg、NIa-Pro、NIb和CP(圖4)，編碼11個功能蛋白。基因組的1～191 bp為5′非編碼區(qū)，192～1 097 bp編碼302 aa組成的相對分子質量約34 100的P1蛋白；1 098～2 468 bp編碼457 aa組成的相對分子質量約52 200的HC-Pro蛋白；2 469～3 512 bp編碼348 aa組成的相對分子質量約40 200的P3蛋白；2 469～3 160 bp+1bp編碼230 aa組成的相對分子質量約26 000的P3N-PIPO蛋白，由P3的N段氨基酸和PIPO組成。3 513～3 671 bp編碼53 aa組成的相對分子質量約5 900的6K1蛋白；3 672～5 576 bp編碼635 aa組成的相對分子質量約71 400的CI蛋白；5 577～5 735 bp編碼53 aa組成的相對分子質量約6 100的6K2蛋白；5 736～6 308 bp編碼191 aa組成的相對分子質量約21 800的VPg蛋白；6 309～7 037 bp編碼243 aa組成的相對分子質量約27 300的NIa-Pro蛋白；7 038～8 594 bp編碼519 aa組成的相對分子質量約59 100的NIb蛋白；8 595～9 407 bp編碼271 aa組成的相對分子質量約30 800的CP蛋白；9 408～9 585 bp為3′非編碼區(qū)。

圖4 ClYVV江蘇蠶豆分離物基因組結構

2.4 ClYVV江蘇蠶豆分離物全基因組序列聚類分析

根據(jù)ClYVV分段序列測序結果，拼接得到完整的ClYVV江蘇蠶豆分離物全基因序列。利用BLAST網(wǎng)站與NCBI上已報道的ClYVV全基因序列進行比對。結果表明ClYVV江蘇蠶豆分離物(ClYVV-JS)核苷酸序列與日本ClYVV No.30分離物(AB011819)同源性最高，達96.37%，與ClYVV安徽合肥分離物(KU922565)同源性為94.74%，而與馬鈴薯Y病毒屬同屬成員菜豆黃花葉病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)、蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus, LMV)、李痘病毒(Plum pox virus, PPV)、大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus, SMV)、西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)、韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus, LYSV)、豌豆種傳黃化病毒(Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV)的同源性僅達50%～70%(表2)。氨基酸序列比對結果顯示ClYVV-JS與ClYVV日本No.30分離物(AB011819)氨基酸序列同源性最高，達99.06%，與其他ClYVV分離物氨基酸序列同源性為93.07%～98.99%(表2)。經(jīng)Clustal W多重序列比對后，利用MEGA7軟件鄰接法進行1 000次自導復制驗證構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示ClYVV-JS與日本No.30分離物(AB011819)、韓國Dendrobium分離物(LC506604)、中國合肥分離物(KU922565)、韓國BH分離物(LC643587)、美國Ca分離物(MW287328)、日本90-1 Br2分離物(AB732962)、美國IA-2016分離物(MK292120)、日本I89-1分離物(LC096082)、韓國Gm分離物(KF975894)歸入一個分支，相對近緣，而與德國NGSTPS18分離物(MW848532)歸入不同分支，相對遠緣，但它們都聚類到ClYVV大分支中(圖5)。這些結果表明從江蘇蠶豆上分離到的病毒屬于三葉草黃脈病毒。

表2 系統(tǒng)進化分析用到的病毒種類及同源性分析

圖5 基于ClYVV全基因組序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 ClYVV江蘇蠶豆分離物基因序列分析

ClYYV全基因組序列聚類分析的結果表明，ClYVV-JS與除德國NGSTPS18(MW848532)分離物外的9個分離物聚于一支，進一步將ClYVV-JS基因組的11個基因序列與這9個分離物進行比對分析。結果(表3)顯示：P1的核苷酸序列與已報道的ClYVV分離物同源性為89.64%～96.91%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高；HC-Pro的核苷酸序列同源性為93.95%～97.16%，與美國Ca分離物(MW287328)同源性最高；P3的核苷酸序列同源性為93.20%～96.84%，與美國IA-2016分離物(MK292120)同源性最高；P3N-PIPO的核苷酸序列同源性為92.63%～97.69%，與日本90-1 Br2分離物(AB732962)同源性最高；6K1的核苷酸序列同源性為89.31%～95.57%，與中國合肥ClYVV分離物(KU922565)同源性最高；CI的核苷酸序列同源性為91.08%～96.38%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高；6K2的核苷酸序列同源性為90.57%～97.48%，與韓國BH分離物、美國IA-2016分離物(LC643587、MK292120)同源性最高；VPg的核苷酸序列同源性為96.51%～97.91%，與日本No.30分離物、日本90-1 Br2分離物(AB011819、AB732962)同源性最高；NIa-Pro的核苷酸序列同源性為96.71%～98.49%，與日本I89-1分離物(LC096082)同源性最高；NIb的核苷酸序列同源性為97.24%～98.46%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高；CP核苷酸序列同源性為94.96%～97.41%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高(表3)。這些結果說明，在ClYVV的11個基因中，VPg、NIa-Pro和NIb這3個基因相較于其他基因變異相對較少，可能相對比較保守。

表3 ClYVV-JS與其他ClYVV分離物基因的同源性分析

3 討論

本研究對2018年江蘇省蠶豆病毒病調查過程中采集的蠶豆疑似病樣進行病毒檢測時發(fā)現(xiàn)，鹽城局部蠶豆田塊存在ClYVV的侵染危害；進而通過分段克隆獲得ClYVV-JS全基因組序列，明確了其基因組結構特征。系統(tǒng)聚類分析結果顯示，該分離物屬于ClYVV的一個病毒株系，其與日本分離物(AB011819)[18]核苷酸序列同源性最高，達96.37%，氨基酸序列同源性達99.06%，而與中國安徽分離物(KU922565)[15]核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為94.74%和98.44%。雖然江蘇與安徽在地域上相對較近，但兩個分離物并未表現(xiàn)出最高的同源性，這個結果說明中國ClYVV的群體結構比較復雜，江蘇的ClYVV侵染源可能不是臨近的安徽。

馬鈴薯Y病毒屬是植物病毒最大的一個屬，能侵染多種單子葉和雙子葉植物，在全世界范圍造成巨大危害[19-20]。三葉草黃脈病毒作為其中重要成員，可侵染白三葉草[21]、蠶豆、豌豆、豇豆及多種豆科作物。生產中，ClYVV可以通過蚜蟲廣泛傳播，嚴重影響侵染對象的產量和品質，該病毒病在世界多個國家均有發(fā)生。

中國蠶豆種植面積位居世界首位，江蘇是中國傳統(tǒng)的蠶豆種植省份，常年種植面積達1.333×105hm2左右[22]。但目前針對蠶豆上的病毒病研究相對較少。2018年，在鹽城、南通、泰州等地蠶豆調查中發(fā)現(xiàn)，ClYVV廣泛存在于蠶豆生產中，重發(fā)田塊發(fā)病率達50%～60%。由于該病毒寄主范圍較廣，易通過蚜蟲或汁液機械傳毒至其他寄主植物，存在潛在流行危害風險。因此，生產中應當密切關注該病毒病的發(fā)生，做好病毒的早期監(jiān)測和預警，適時控制傳毒介體蚜蟲，切斷傳毒途徑，控制該病毒病發(fā)生與擴散，減少損失。