周旭旭， 劉金洋， 陳 新， 薛晨晨， 陳景斌， 林 云， 閆 強， 吳然然， 朱月林， 袁星星

(1.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇南京210095；2.江蘇農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京210014)

Alfin1-like蛋白家族是PHD蛋白家族中的1個亞家族，其N端有1個Alfin結(jié)構(gòu)域，C端有1個保守的PHD-finger結(jié)構(gòu)域。Alfin1-like基因只存在于植物中，其在進化上也是非常保守的，具有4個內(nèi)含子和5個外顯子[1]。Alfin1-like蛋白與植物的耐鹽性有很大關系。第一個Alfin1蛋白是從苜蓿中分離出來的[2]，過表達Alfin1基因可以增強植物的耐鹽性[3]。在其他作物中，Alfin1-like蛋白在應對鹽脅迫、干旱脅迫等逆境中都有很重要的調(diào)節(jié)作用，比如過表達大豆中GmPHD2(1種編碼Alfin1的基因)的擬南芥表現(xiàn)出耐鹽性[4]。在鷹嘴豆的干旱脅迫分析中，發(fā)現(xiàn)1個Alfin1-like轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下，上調(diào)表達， 該轉(zhuǎn)錄因子可能與抗旱相關[5]。

綠豆是亞洲重要的豆類作物，也是中國重要的小雜糧作物。綠豆富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和碳水化合物，是一種優(yōu)質(zhì)的膳食原料[6]。本課題組前期以蘇綠1號為試驗材料完成了全基因組測序和鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序，在獲得的基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中均能檢測到Alfin1-like基因家族的10個成員。因此，本研究首先在全基因組水平上，通過比較基因組學分析對VrAL(綠豆Alfin1-like)基因進行鑒定，并對其家族成員啟動子及基因復制進行分析，研究綠豆中該基因家族的復制特征。其次，用含有20% PEG6000(聚乙二醇6000)的Hoagland營養(yǎng)液處理綠豆幼苗，采用qRT-PCR探究VrAL基因家族對PEG模擬干旱的響應特點。旨在探索VrAL基因家族成員在干旱脅迫下基因表達的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料的處理與獲得

試驗材料為綠豆[Vignaradiata(L.)Wilczek]蘇綠1號，在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所溫室內(nèi)以蛭石為基質(zhì)進行穴盤育苗，每盤培育50株幼苗，共2個穴盤，用1/2濃度的Hoagland營養(yǎng)液[7]進行底面吸肥，每2 d更換1次營養(yǎng)液。

播種后10 d，第1對真葉充分展開后，參照曹志敏等[8]的方法，在1個穴盤的營養(yǎng)液中添加20%的PEG6000模擬干旱脅迫；對照組穴盤的營養(yǎng)液中不添加PEG6000。參照謝敏等[9]的方法，在綠豆幼苗被脅迫0 h、12 h、24 h、36 h時分別在處理組和對照組隨機取樣5株，取葉片和根部組織各0.1 g保存于液氮中，為qRT-PCR分析備用。

1.2 全基因組VrAL家族成員鑒定

基因家族成員鑒定遵循以下步驟：①使用7條擬南芥AL蛋白序列和綠豆蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行本地BLAST搜索，E值設置為1×10-10，獲得綠豆AL家族候選序列，擬南芥和綠豆蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)從NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載[10]。②將AL家族候選序列在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行Pfam檢測，去除不含Alfin1-like結(jié)構(gòu)域的序列。③ 將獲得的AL家族序列與本課題組之前完成的蘇綠1號全基因組測序數(shù)據(jù)進行比較以確認所獲得序列的準確性。④將10條VrAL家族蛋白質(zhì)序列上傳到在線網(wǎng)站ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分析VrAL家族蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[11]，用在線網(wǎng)站Cell-PLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進行亞細胞定位預測[12]。

1.3 VrAL基因結(jié)構(gòu)及進化分析

使用TBtools工具[13]進行基因結(jié)構(gòu)分析并進行可視化操作。利用在線網(wǎng)站(Phytozome doe.gov)獲得水稻、大豆、玉米的基因數(shù)據(jù)，從中挑選出用擬南芥AL基因家族注釋的基因，并獲得其氨基酸序列。再用Clustal W對擬南芥、水稻、大豆、玉米、綠豆AL家族的蛋白質(zhì)序列進行序列比對。最后，在MEGA 7.0中用鄰接(Neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap設置為1 000次，其他設置選擇默認參數(shù)。

1.4 VrAL基因家族的染色體定位、啟動子及基因復制分析

利用TBtools工具從綠豆基因組中VrAL基因家族5′端上游各選2 000 bp，使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線網(wǎng)站對基因家族成員進行啟動子分析[14]。從預測結(jié)果篩選出與植物激素響應及逆境響應相關的元件，并用TBtools工具將其可視化。為了進一步分析基因重復事件，本研究擬分析非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)，估算各旁系之間的Ka/Ks比值，以檢測該基因家族在進化中受到的選擇壓力。

1.5 VrAL家族蛋白質(zhì)的多序列比對及互作蛋白質(zhì)預測

利用DNAman對綠豆10個AL家族蛋白質(zhì)進行多序列比對[9]，并將綠豆10條AL蛋白的氨基酸序列上傳至在線網(wǎng)站string(https://www.string-db.org/)進行互作蛋白質(zhì)預測，Network type設置為full STRING，Required score設置為medium confidence(0.400)。

1.6 PEG模擬干旱脅迫下VrAL家族的qRT-PCR分析

利用植物RNA提取試劑盒[DP419，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品]來提取總RNA。使用植物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TSK302M，南京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品)進行反轉(zhuǎn)錄。用內(nèi)參基因檢驗反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈的完整性。使用NCBI Primer designing tool(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在線設計VrAL基因家族的qRT-PCR特異性引物，并用TBtools-primer check檢查引物的特異性。引物信息見表1。以反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 為模板，使用熒光定量試劑盒(TSE201，南京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品)進行qRT-PCR分析。每個樣品進行5次生物學重復和3次技術(shù)重復。利用VrAL基因的循環(huán)數(shù)閾值(Ct)減去內(nèi)參基因的Ct，得到△Ct后，用 2-△Ct法計算相對表達量[15]，使用SPSS統(tǒng)計軟件對基因表達水平進行 Duncan’s 檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1 VrAL基因家族及內(nèi)參基因熒光定量引物

2 結(jié)果和分析

2.1 VrAL蛋白家族成員的生化特性

經(jīng)過BLAST比對和挑選，綠豆全基因組中共鑒定到10個AL基因。根據(jù)它們在染色體上的分布，依次命名為VrAL1～VrAL10。綠豆VrAL基因的編碼區(qū)(Coding sequence，CDS)位于717(VrAL8)～765 bp(VrAL3)，編碼的氨基酸序列長度為239～255 aa，相對分子質(zhì)量為27 000～28 800，理論等電點為4.91(VrAL2)～6.24(VrAL9)。親水性預測結(jié)果表明，VrAL蛋白均為親水性蛋白質(zhì)(表2)。VrAL蛋白亞細胞定位預測結(jié)果表明，VrAL蛋白均定位在細胞核。

表2 綠豆AL基因家族成員及其編碼蛋白質(zhì)的生化特性

2.2 VrAL保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)及進化樹分析

從進化樹可以看出，10個VrAL基因分出3個分支，VrAL1、VrAL6、VrAL7、VrAL3基因?qū)儆诘谝粋€分支，VrAL10、VrAL8、VrAL5、VrAL4、VrAL9屬于第二個分支，VrAL2單獨在最后一個分支上；從進化樹上可以看出，VrAL基因家族的進化過程中存在基因復制事件，VrAL基因家族共存在5個基因?qū)?，包?個基因(VrAL1/VrAL6、VrAL1/VrAL7、VrAL5/VrAL8、VrAL5/VrAL10、VrAL4/VrAL9)(圖1a)。10個VrAL蛋白都含有Alfin1-like蛋白結(jié)構(gòu)域(pfam12165)和PHD蛋白結(jié)構(gòu)域(pfam00628)(圖1b)。基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，10個VrAL基因比較保守，都含有4個內(nèi)含子和5個外顯子(圖1c)，這與擬南芥中AL基因結(jié)構(gòu)相同[16]。

圖1 VrAL基因家族系統(tǒng)進化樹(A)、對應的Pfam結(jié)構(gòu)(B)及基因結(jié)構(gòu)(C)

利用擬南芥(7個)、大豆(16個)、玉米(17個)、水稻(8個)及綠豆(10個)AL蛋白全長序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。根據(jù)進化關系，這58個AL蛋白可分為3類，VrAL在3類中都有分布。

圖2 綠豆、擬南芥、大豆、玉米及水稻AL基因家族系統(tǒng)進化樹

2.3 VrAL基因的順式作用元件、染色體定位及復制分析

從PlantCARE在線網(wǎng)站中預測VrAL基因家族成員上游2 000 bp序列，這些序列除了具有光響應、逆境響應和無氧響應元件外還具有多種植物激素(茉莉酸甲酯、生長素、水楊酸、脫落酸等)響應元件(圖3)。其中VrAL1、VrAL2、VrAL4、VrAL6、VrAL8的啟動子區(qū)域存在脫落酸響應元件，VrAL2、VrAL3、VrAL4、VrAL6、VrAL9的啟動子區(qū)域存在茉莉酸甲酯響應元件，VrAL2、VrAL4、VrAL6、VrAL9的啟動子區(qū)域存在干旱脅迫響應元件，VrAL4、VrAL6、VrAL7、VrAL8的啟動子區(qū)域存在逆境響應元件，VrAL3、VrAL7、VrAL9的啟動子區(qū)域存在SA響應元件，VrAL2、VrAL6、VrAL7的啟動子區(qū)域存在生長素響應元件。AL基因家族在其他物種中被報道主要與植物的生長發(fā)育以及抗逆境脅迫有關，這與VrAL基因家族的啟動子作用元件的分析結(jié)果也是一致的。

MeJA:茉莉酸甲酯響應元件；MBS：干旱脅迫響應元件；TC：逆境響應元件；ABA：脫落酸響應元件；Auxin：生長素響應元件；SA：水楊酸響應元件。

9個VrAL基因定位在5條染色體上，VrAL1、VrAL2、VrAL3、VrAL4定位在第5條染色體上，VrAL5定位在第6條染色體上，VrAL6定位在第7條染色體上，VrAL7、VrAL8定位在第9條染色體上，VrAL9定位在第11條染色體上，VrAL10暫時不確定定位在幾號染色體上(表2)。綠豆種內(nèi)的AL基因家族共線性分析結(jié)果表明，10個VrAL基因存在5個基因?qū)?，分別是VrAL1/VrAL6、VrAL1/VrAL7、VrAL5/VrAL8、VrAL5/VrAL10、VrAL4/VrAL9(圖4)。Ka/Ks的計算結(jié)果顯示，除了VrAL4/VrAL9由于序列差異過大無法計算Ka/Ks外，其他同源基因?qū)rAL1/VrAL6、VrAL1/VrAL7、VrAL5/VrAL8、VrAL5/VrAL10的Ka/Ks值都小于0.20(表3)。上述結(jié)果表明，重復的VrAL基因在進化過程中受到純化選擇[17]。片段復制是VrAL基因家族進化的主要方式，在VrAL基因家族進化中起重要作用，這與大豆AL家族中的研究結(jié)果一致[4]。

片段復制的基因用直線連接。

表3 VrAL基因家族同源基因?qū)Φ腒a/Ks

2.4 VrAL家族蛋白質(zhì)的多序列比對及其互作蛋白預測

10個VrAL蛋白的多序列比對結(jié)果如圖5所示，其中N端含有1個長約130個氨基酸的Alfin結(jié)構(gòu)域(pfam12165)，C端含有1個長約50個氨基酸的PHD結(jié)構(gòu)域(pfam00628)。其中加粗實線框為PHD結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸，10個VrAL蛋白中只有VrAL2在該位點不是酪氨酸。利用蛋白質(zhì)互作預測在線網(wǎng)站String預測綠豆中與AL蛋白互作的蛋白質(zhì)，其功能注釋主要有 E3 泛素蛋白連接酶DRIP2及其亞體、組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶ASHR3、ATP合成相關的酶、普通的應激A蛋白、DEAD-box ATP依賴性RNA解旋酶5等。

實線框為Alfin結(jié)構(gòu)域(pfam12165)；虛線框為PHD結(jié)構(gòu)域(pfam00628)；加粗實線框為酪氨酸。

2.5 VrAL基因家族在PEG模擬干旱條件下的qRT-PCR分析

如圖6所示，在20%PEG培養(yǎng)條件下，綠豆根中有4個VrAL的相對表達量比對照組顯著或極顯著增加，分別是VrAL1(圖6A)、VrAL5(圖6B)、VrAL7(圖6C)、VrAL9(圖6D)。VrAL1在用20%PEG培養(yǎng)12 h后相對表達量開始升高， 24 h時相對表達量達到所選取時間段的最高值，約為同時間對照組的7倍，36 h時相對表達量下降，大約是同時間對照組的2倍。VrAL5和VrAL7在處理組中的相對表達量一直處于增長的趨勢，在36 h時的相對表達量約是對照組的3倍。VrAL9在用20%PEG培育12 h時，相對表達量達到所選時間段中的最高值，是同時間段對照組的3倍，之后開始下降。VrAL2、VrAL3、VrAL4、VrAL6、VrAL8和VrAL10在根部處理組中的表達和對照組無明顯差異。

A、B、C、D分別表示根部4個基因VrAL1、VrAL5、VrAL7、VrAL9的qRT-PCR分析。*表示用t測驗在0.05水平差異顯著，**表示用t測驗在0.01水平差異顯著，NS表示兩組間無顯著差異(P>0.05)。

如圖7所示，在綠豆葉片中有3個VrAL在用20%PEG培育后上調(diào)表達，分別是VrAL8(圖7A)、VrAL9(圖7B)和VrAL10(圖7C)。VrAL8和VrAL9都是在用20%PEG培養(yǎng)12 h后相對表達量達到最高值，分別約是對照組的2.2倍和4.2倍，之后相對表達量開始下降。VrAL10在用20%PEG培養(yǎng)12 h后相對表達量開始上升，到36 h達到最高值，約是對照組的3倍。其他7個基因的相對表達量和對照組無明顯差異。

A、B、C分別表示葉片3個基因VrAL8、VrAL9和VrAL10的qRT-PCR分析。*表示用t測驗在0.05水平差異顯著，**表示用t測驗在0.01水平差異顯著，NS表示兩組間無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 生物信息學預測VrAL基因家族功能

本研究從綠豆基因組中鑒定出10個AL成員，這些成員的結(jié)構(gòu)非常相似。與其他物種(擬南芥、大豆、玉米、水稻)的AL基因結(jié)構(gòu)也非常相似，暗示AL基因家族在植物界是非常保守的。AL蛋白家族通常作為一種轉(zhuǎn)錄因子。VrAL蛋白的亞細胞定位預測結(jié)果顯示其全部定位在細胞核，預測VrAL蛋白是作為一種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。順式作用元件分析結(jié)果顯示，大多數(shù)VrAL啟動子序列中含有逆境和激素響應元件，預測VrAL在綠豆抗非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

從植物進化的關系上來看，植物中都存在AL基因，從低等植物萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)到高等植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、苜蓿(MedicagosativaL.)、水稻(OryzasativaL.)、大豆[Glycinemax(L.) Merr.]、玉米(ZeamaysL.)、毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. & Gray)、葡萄(VitisviniferaL.)、榆錢菠菜(AtriplexhortensisL.)和大白菜(BrassicarapaL.)中都有報道[4，18-20]。通過多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，VrAL家族中有3組同源基因，VrAL1、VrAL6、VrAL7屬于一組，VrAL5、VrAL8、VrAL10屬于一組，VrAL4和VrAL9屬于一組。這3組基因在進化過程中存在片段復制現(xiàn)象。通過蛋白質(zhì)互作預測也發(fā)現(xiàn)與VrAL家族蛋白質(zhì)互作的蛋白質(zhì)主要有E3泛素蛋白連接酶DRIP2及其亞體、組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶ASHR3、ATP合成相關的酶、普通的應激A蛋白、DEAD-box ATP依賴性RNA解旋酶5等，表明VrAL家族基因在調(diào)控綠豆生長發(fā)育過程中起著不可忽視的作用。

擬南芥AL蛋白具有與活性組蛋白標記H3K4me3/2和順式作用元件GNGGTG/GTGGNG結(jié)合的能力，表明AL家族作為一種轉(zhuǎn)錄因子可能主要通過結(jié)合DNA來抑制其他基因的轉(zhuǎn)錄來起作用。AL蛋白與H3K4me3/2結(jié)合能力的有無通常與AL蛋白C末端PHD結(jié)構(gòu)中的酪氨酸密切相關。擬南芥中的7個AL蛋白中只有AL3的PHD結(jié)構(gòu)中不含有酪氨酸，組蛋白肽下拉試驗結(jié)果也證明AL3確實不能與H3K4me3/2結(jié)合[21]。在VrAL蛋白的多序列比對中發(fā)現(xiàn)，VrAL2蛋白的PHD結(jié)構(gòu)域不含酪氨酸，預測VrAL2蛋白可能沒有與H3K4me3/2結(jié)合的能力。

3.2 VrAL基因參與干旱脅迫的響應

AL基因家族是PHD基因家族中的一個亞家族，但是只存在于植物的PHD家族中。AL轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物的生長發(fā)育以及抵抗逆境脅迫中起重要作用。苜蓿中Alfin1蛋白可以調(diào)節(jié)MsPRP2基因的表達，該基因編碼一種富含脯氨酸的細胞壁蛋白質(zhì)，并積極調(diào)節(jié)植物的耐鹽性和抗旱性[3，22-23]。在擬南芥中，AtAL5蛋白可與8個目標基因(SHMT7、bZIP50、CAX1、TAC1、FAO、OFE、NAC075和WRKY11)的啟動子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，其中5個基因(TAC1、SHMT7、FAO、OFE和CAX1)的敲除突變體均表現(xiàn)出對鹽、干旱和冷凍脅迫的耐受性增強[24]，AtAL6控制多個下游基因的表達，包括ETC1、NPC4、SQD2和PS2，以促進缺磷條件下的根毛伸長[25]。在榆樹中發(fā)現(xiàn)AhAL1結(jié)合GRF7、DREB1C和幾個與ABA相關的編碼基因的啟動子區(qū)域，并下調(diào)其表達；在AhAL1轉(zhuǎn)基因植物中DREB2A、DREB1A和3個ABF基因的表達量增加[26]。在對耐旱和干旱脅迫敏感的水稻的轉(zhuǎn)錄組比較中也發(fā)現(xiàn)，部分AL基因響應干旱脅迫[27]。在對鷹嘴豆的干旱脅迫分析中也發(fā)現(xiàn)1個對干旱響應表達上調(diào)非常明顯的AL轉(zhuǎn)錄因子[5]。但是綠豆中的AL家族還沒有相關的研究報道。在本試驗中，PEG模擬的干旱脅迫下，綠豆根部和葉片中VrAL1、VrAL5、VrAL7、VrAL8、VrAL9和VrAL10上調(diào)表達。推測VrAL1、VrAL5、VrAL7、VrAL8、VrAL9、VrAL10的上調(diào)表達和綠豆抵抗干旱脅迫有關，具體的調(diào)控網(wǎng)絡還有待進一步的研究。