劉 浩 方 圓 潘天岳 方 剛 劉軼凡 蔣小浪 陳 斌 顧史洋 魏 征 劉 澎 董智慧 符偉國

重度肢體缺血(critical limb ischemia，CLI)是下肢動脈疾病的終末階段，主要表現(xiàn)為靜息痛、缺血性潰瘍及壞疽。國外研究[1]結果顯示，CLI患者的截肢率為10%～40%，截肢后的患者5年死亡率仍高達70%，給國家、社會及家庭帶來沉重的負擔。目前，主流的CLI治療方法包括開放手術及腔內治療，前者包括下肢動脈旁路移植術、下肢動脈內膜剝脫術等，后者包括支架植入、球囊擴張、下肢動脈腔內減容術等。然而，接受上述常規(guī)治療后，仍有15%～20%的CLI患者術后血管再閉塞發(fā)生率和截肢率均較高，被稱為難治性重度肢體缺血(no-option critical limb ischemia，NO-CLI)患者[2-6]。相較于其他CLI患者，NO-CLI患者預后不盡如人意，術后1年死亡率為20%～40%、截肢率高達30%～50%[7-10]。血管炎性重度肢體缺血(angiitis-induced critical limb ischemia，AICLI)是指由血管閉塞性脈管炎(thromboangiitis obliterans，TAO)及其他免疫系統(tǒng)疾病導致的CLI，其特點為肢體遠端中小動脈受累，導致血管缺乏“流出道”，且由于疾病本身原因，術后極易發(fā)生血管再閉塞，故AICLI是NO-CLI的重要組成部分。TAO亦稱伯格病(Buerger’s disease)，由Buerger醫(yī)師于1908年首次報道[11]。TAO的發(fā)病率并不高，但AICLI患者中TAO占比極高[11-13]。

細胞移植療法由Asahara等[14]于1997年率先提出，其在治療TAO等NO-CLI疾病方面的安全性和有效性已經研究[13-14]證實。目前，治療TAO的細胞產物包括骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cell，BMMNC)、外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMNC)及純化CD34+細胞(purified CD34+cell，PCC)。BMMNC需于全身麻醉下行腰椎穿刺獲取，具有創(chuàng)傷性，故BMMNC移植在臨床應用受限。目前臨床常采用PBMNC或PCC移植治療TAO，但兩者的長期安全性和有效性是否存在差異尚不明確。本研究通過回顧性分析并比較47例接受PBMNC或PCC移植的TAO患者的長期隨訪結果，旨在總結這兩類細胞產物的特點及其優(yōu)勢。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇自2014年8月—2016年12月于復旦大學附屬中山醫(yī)院血管外科確診為TAO并接受細胞移植治療的患者43例，均為男性；年齡范圍20～58歲，年齡為(41.7±10.6)歲。根據(jù)移植的細胞產物將患者分為PBMNC組(23例)和PCC組(20例)。所有患者的診斷均符合Shionoya診斷標準[15]。納入及排除標準參考文獻[13]。納入標準：①18～80歲的男性或女性；②經CTA、MRA和(或)DSA檢查示下肢動脈狹窄程度>70%或完全閉塞，患者的臨床缺血癥狀(靜息痛、潰瘍)與檢查結果相符；③處于下肢CLI狀態(tài)(靜息痛為盧瑟福4級、潰瘍?yōu)楸R瑟福5級[16]，<4級為非CLI狀態(tài))；④下肢靜息痛和(或)潰瘍經保守治療(包括抗凝、抗血小板聚集、擴血管、運動治療和嚴格戒煙)≥1個月后無緩解或好轉；⑤經外科開放手術或腔內治療后3個月，癥狀仍無好轉。排除標準：①移植前3個月內發(fā)生嚴重不良事件，包括心肌梗死、腦卒中、嚴重肝功能不全和腎功能不全、肺栓塞等；②預期壽命<1年；③增殖性視網(wǎng)膜病變；④存在注射粒細胞集落刺激因子(C-GSF)禁忌。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核并批準(倫理號為Y2019-099)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 細胞移植的方法參考文獻[2]。所有患者均予皮下注射人重組粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF;上午9時300 μg，下午3時150 μg，每日共450 μg)及低分子肝素(4 100 U)，連續(xù)注射5 d,每日監(jiān)測血常規(guī)指標。于第5天晨皮下注射rhG-CSF 300 μg，靜脈注射葡萄糖酸鈣1 g及地塞米松5 mg后，行頸靜脈及股靜脈穿刺置管。將兩根靜脈置管分別連接至COM.TEC血細胞分離機(德國費森尤斯公司)進行血漿分離置換獲得PBMNC，再將PBMNC于免疫磁珠分選儀器(德國美天旎公司)上進行細胞純化獲得PCC。采用錐蟲藍染色測定準備移植的PBMNC、PCC的細胞活力，并行流式細胞術檢測直接計算出PBMNC、PCC的CD34+細胞濃度。準備完畢后，于全身麻醉下將PBMNC或PCC在缺血側下肢(注射范圍為小腿及足部)行均勻肌內注射，每點注射PBMNC或PCC 0.5 mL；干細胞移植流程見圖1。所有患者移植后均長期口服拜阿司匹林(0.1 g，每日1次)及西洛他唑(0.1 g，每日2次)。

1.3 數(shù)據(jù)收集 收集所有患者術前的基線資料：年齡、BMI、合并癥(高血壓病、糖尿病、高脂血癥)、吸煙史、既往史(冠心病、腦血管疾病、肺栓塞)，肢體缺血部位、CLI的盧瑟福分級，藥物治療情況(抗血小板藥物、西洛他唑、前列腺素類藥物、抗凝藥物)、手術類型[旁路移植術、內膜剝脫術、支架植入術、球囊擴張術、交感神經切除術、溶栓術、大截肢(踝上截肢)]。記錄并比較兩組移植細胞產物的體積和移植CD34+細胞數(shù)量。

A 患者行血漿分離置換 B PBMNC上機進行純化C 左為PBMNC，右為純化PCC D 對患者患側小腿及足部進行均勻肌內注射圖1 患者接受干細胞移植的流程

1.4 觀察指標 觀察指標包括安全性指標和有效性指標。安全性指標：圍手術期全因死亡、開始注射rhG-CSF至移植后2周內發(fā)生的不良事件(心肌梗死、腦梗死、肝腎功能異常、白細胞計數(shù)持續(xù)增高、注射點疼痛)，以及隨訪期間有無病理性視網(wǎng)膜增生發(fā)生。

有效性指標：無大截肢生存率(major amputation-free survival，MAFS)、無痛步行時間(pain-free walking time，PFWT)、Wong-Baker面部疼痛評分(Wong-Baker faces pain rating scale，WBFPS)、踝肱指數(shù)(ankle-brachial index，ABI)、趾肱指數(shù)(toe-brachial index，TBI)、經皮氧分壓(transcutaneous oxygen pressure，TcPO2)、盧瑟福分級及復發(fā)。PFWT是患肢的功能學指標，WBFPS用于評價患者靜息痛程度，ABI、TBI和TcPO2用于評估患肢血供情況。復發(fā)定義為移植側肢體缺血緩解后再次轉為CLI狀態(tài)。所有患者于移植后第1、2、3、6、9、12個月進行隨訪，此后每年隨訪1次，記錄移植前和移植后1、3、5年的PFWT、ABI、TBI、TcPO2，以及非CLI狀態(tài)的患者比例。

2 結 果

2.1 兩組基線資料比較 兩組患者的年齡、BMI，以及合并癥、吸煙史、既往史、肢體缺血部位、CLI的盧瑟福分級、藥物治療情況和手術類型的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較

2.2 兩組細胞產物比較 PBMNC組移植的細胞體積為(80.2±12.4) mL，顯著大于PCC組的(40.1±2.6) mL (P<0.001)。PCC組的CD34+細胞比例為(69.42±12.02)%，顯著高于PBMNC組的(0.31±0.12)%(P<0.001)。所有患者移植CD34+細胞數(shù)量均>1×105個/kg。PBMNC組、PCC組患者移植CD34+細胞數(shù)量分別為(4.2±1.6)×105、(3.6±1.2)×105個/kg，兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.177)。

2.3 安全性指標比較 兩組圍手術期均無全因死亡患者，開始注射rhG-CSF至移植后2周內亦未發(fā)生心肌梗死、腦梗死、肝腎功能異常、白細胞計數(shù)持續(xù)增高。12例患者術后有注射點疼痛，其中PBMNC組注射點疼痛發(fā)生率為43.5%(10/23)，顯著高于PCC組的2/20(P=0.015)。 隨訪期間兩組患者均未發(fā)生增殖性視網(wǎng)膜病變。

2.4 有效性指標比較 PCC組1例患者于移植后1個月失訪，1例患者于移植后51個月因肺部感染死亡。余患者隨訪時間均≥5年。所有患者術后隨訪時間范圍1～87個月，隨訪時間為(69.0±17.2)個月。PBMNC組1例患者于術后2個月行大截肢，1例患者于術后41個月行大截肢。PBMNC組移植后第5年的MAFS為91.3%，PCC組為94.7%，兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.651)。

兩組間移植前和移植后1、3、5年的PFMT、WBFPS、ABI、TBI、TcPO2的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。與同組移植前比較，兩組移植后1、3、5年的PFMT均顯著延長(P值均<0.001)，WBFPS均顯著降低(P值均<0.001)，ABI、TBI、TcPO2均顯著增高(P值均<0.001)。見表2。

移植前所有患者盧瑟福分級均為5級。PBMNC組移植后1、6個月和1、3、5年非CLI狀態(tài)的患者比例[21.7%(5/23)、69.6%(16/23)、82.6%(19/23)、87.0%(20/23)、82.6%(19/23)]均顯著高于同組移植前(0，P值均<0.05)，PCC組移植后6個月和1、3、5年非CLI狀態(tài)的患者比例(0、7/19、14/19、16/19、15/18)均顯著高于同組移植前(0，P值均<0.05)。PBMNC組移植后1、6個月非CLI狀態(tài)的患者比例均顯著高于PCC組同時間點(P值均<0.05)，兩組間移植后1、3、5年非CLI狀態(tài)患者比例的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

表2 兩組移植前后有效性指標比較

隨訪過程中，共有4例患者移植后復發(fā)，其中PBMNC組3例，PCC組1例。PBMNC組中1例患者于移植后40個月復發(fā)缺血性潰瘍，后因缺血進展過快合并感染行大截肢；1例患者術后43個月復發(fā)缺血性潰瘍，經保守治療(藥物及運動治療)后癥狀緩解；1例患者術后4年復發(fā)靜息痛，經保守治療緩解。PCC組1例患者術后50個月復發(fā)缺血性潰瘍，于術后51個月因肺部感染死亡。

3 討 論

早在19世紀TAO就已被報道，但直至目前對其發(fā)生、發(fā)展的機制仍知之甚少，TAO可導致嚴重后果，一些中青年男性患者因TAO而截肢，喪失了勞動力，給家庭、社會和國家造成沉重的負擔。在細胞療法出現(xiàn)之前，開放手術及腔內治療作為治療TAO的主流方法，并未取得令人滿意的效果。旁路移植術后的1年通暢率僅為41%，Ⅱ期通暢率為54%，踝上截肢率高達31%，且有34.8%的患者在42歲前喪失勞動力[17-18]。腔內治療術后1年的無截肢或無再干預率僅為70.9%[19]。細胞療法治療TAO的安全性和有效性現(xiàn)已被相關研究[13-14]證實。

復旦大學附屬中山醫(yī)院血管外科自2009年起開展自體細胞移植治療NO-CLI的臨床研究，迄今已治療190余例患者，其中TAO患者比例高達90%以上[13]。為了對比移植PBMNC與PCC治療TAO的長期療效，本研究回顧性納入了自2014年8月—2016年12月于復旦大學附屬中山醫(yī)院血管外科接受PBMNC或PCC移植的43例患者，納入患者符合TAO的臨床特征，即以年輕男性為主、吸煙、存在低心血管風險因素。本研究結果顯示，PBMNC組、PCC組移植后第5年的MAFS分別為91.3%、94.7%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義；表明兩類細胞產物治療均能使TAO患者獲得滿意的保肢效果。兩組間移植前和移植后1、3、5年的PFMT、WBFPS、ABI、TBI、TcPO2的差異均無統(tǒng)計學意義；與同組移植前比較，兩組移植后1、3、5年的PFMT均顯著延長，WBFPS均顯著降低，ABI、TBI、TcPO2均顯著增高；提示PBMNC和PCC移植后患肢血供和功能均改善明顯。PBMNC組移植后1、6個月和1、3、5年非CLI狀態(tài)的患者比例均顯著高于同組移植前，PCC組移植后6個月和1、3、5年非CLI狀態(tài)的患者比例均顯著高于同組移植前；表明PBMNC組移植后1個月盧瑟福分級即有改善，而PCC組直至移植后6個月盧瑟福分級才有改善；推測盧瑟福分級改善時間不同與兩種細胞的構成有關。雖然CD34+細胞被認為是細胞療法中促進血管新生的主要效應細胞，但CD34-細胞也可分泌大量促血管新生因子[20]。因此，PBMNC移植不僅可通過CD34+細胞的遷移、分化、旁分泌等作用促進血管新生，還有著CD34-細胞的旁分泌作用。

本研究結果顯示，PBMNC組注射點疼痛發(fā)生率顯著高于PCC組；兩組均無圍手術期全因死亡患者，開始注射rhG-CSF至移植后2周內亦未發(fā)生心肌梗死、腦梗死、肝腎功能異常、白細胞計數(shù)持續(xù)增高，隨訪期間兩組患者均無病理性視網(wǎng)膜增生發(fā)生。上述結果提示，PBMNC和PCC移植均具有安全性。推測PBMNC組注射點疼痛發(fā)生率顯著高于PCC組的原因有兩點：①PBMNC組移植的細胞體積顯著大于PCC組，導致移植后小腿及足部組織腫脹更為明顯；②PCC組中CD34-細胞比例較低，雖然CD34-細胞可產生促血管新生的旁分泌作用，但其移植后可發(fā)生炎癥反應，對組織產生刺激作用。

通過本研究的結果，總結兩類細胞產物移植治療TAO的特點為PBMNC能較快地緩解缺血癥狀，PCC移植后注射點疼痛發(fā)生少。因此，對于缺血進展快、缺血程度嚴重的患者，推薦移植PBMNC，從而盡早緩解缺血癥狀，提高保肢率；對于靜息痛嚴重的患者，推薦移植PCC，移植后注射點疼痛發(fā)生少，有助于減輕患者靜息痛。

綜上所述，TAO患者經PBMNC或PCC移植治療后均獲得令人滿意的長期療效。PBMNC移植后早期即可改善盧瑟福分級，而PCC移植后注射點疼痛發(fā)生較少。然而，本研究病例數(shù)量較少，有待更大規(guī)模的前瞻性臨床試驗來驗證這一結論。