李昌亮，尚金鳳，廖正華，蔡立榮，易必新，馬曉寧*（.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，長(zhǎng)沙 4000；2.藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 4000；.天地恒一制藥股份有限公司，長(zhǎng)沙 40）

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺是美國(guó)吉利德公司在富馬酸替諾福韋二吡呋酯基礎(chǔ)上所開(kāi)發(fā)的新一代核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（見(jiàn)圖1）。吉利德公司報(bào)道合成富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的工藝路線主要有兩條，一條是2001年報(bào)道的早期合成路線，一條是2012年報(bào)道的一種制備光學(xué)純替諾福韋艾拉酚胺的不對(duì)稱合成工藝[1-2]。兩條合成路線中均使用了L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽作為反應(yīng)物，用量較大會(huì)有殘留[3-7]。富馬酸替諾福韋艾拉酚胺在放置過(guò)程中也可能降解產(chǎn)生L-丙氨酸異丙酯。檢索發(fā)現(xiàn)，L-丙氨酸異丙酯的檢測(cè)方法較少，雖然有報(bào)道高效液相色譜法檢測(cè)本品中的有關(guān)物質(zhì)，但未將L-丙氨酸異丙酯作為特定雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[8]，尚未發(fā)現(xiàn)有采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)富馬酸替諾福韋艾拉酚胺中L-丙氨酸異丙酯含量的報(bào)道[9-12]。因此本研究建立一種液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定富馬酸替諾福韋艾拉酚胺中的L-丙氨酸異丙酯含量，以保障藥品質(zhì)量安全及滿足藥品監(jiān)管需要。

圖1 富馬酸替諾福韋艾拉酚胺（A）和L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽（B）的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structural of tenofovir alafenamide fumarate（A）L-alanine isopropyl ester hydrochloride（B）

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、Thermo TSQ Endura 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛）；Mettler Toledo XP205 電子分析天平（美國(guó)梅特勒）。

1.2 試藥

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺（批號(hào)：200501、200502、200601，含量：98.8%、99.2%、99.7%，天地恒一制藥股份有限公司）；L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽對(duì)照品（批號(hào)：1-WS-117-1，來(lái)源：TRC，純度：98%）；甲酸、乙腈均為色譜純；純化水為T(mén)hermo Scientific Barnstead Genpure 純化水系統(tǒng)制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（見(jiàn)表1）；流速：0.4 mL·min－1；柱溫：40℃；進(jìn)樣器溫度：10℃；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 源；檢測(cè)模式：正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子對(duì)：母離子m/z132，子離子m/z90、44；接口電壓為4.5 kV，接口溫度為300℃，DL 管溫度為180℃，加熱塊溫度為200℃，干燥器流速為5 L·min－1，m/z132/90 碰撞能量為16 V，m/z132/44 碰撞能量為16 V，碰撞氣體為高純氬氣。

2.3 溶液配制

2.3.1 空白溶劑 即稀釋劑，為20%乙腈水溶液。

2.3.2 供試品溶液 取富馬酸替諾福韋艾拉酚胺約15 mg，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加稀釋劑適量，超聲使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液 取L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽（分子量：167.6）對(duì)照品約15 mg，精密稱定，置200 mL 量瓶中，用稀釋劑適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液[L-丙氨酸異丙酯（分子量：131.1）質(zhì)量濃度約為60 μg·mL－1]；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑至刻度，搖勻，制成對(duì)照品溶液（L-丙氨酸異丙酯質(zhì)量濃度約為0.6 μg·mL－1）。

2.4 專屬性

分別取空白溶劑、供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析并記錄色譜圖，結(jié)果供試品溶液色譜圖中L-丙氨酸異丙酯的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，空白溶劑無(wú)干擾，表明方法專屬性良好，見(jiàn)圖2。

圖2 L-丙氨酸異丙酯測(cè)定的典型色譜圖Fig 2 Typical chromatogram of L-alanine isopropyl ester

2.5 檢測(cè)限和定量限

精密移取“2.3.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋合適倍數(shù)后進(jìn)樣，分別將信噪比（S/N）為3 和10 的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果L-丙氨酸異丙酯的檢測(cè)限為0.02 μg·mL－1，定量限為0.06 μg·mL－1。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密移取“2.3.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，制得系列線性溶液。以L-丙氨酸異丙酯峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果回歸方程為Y＝1.821×107X－1.568×105，r＝0.9994，線性范圍為0.06～1.19 μg·mL－1。

2.7 精密度

取“2.3.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄L-丙氨酸異丙酯的峰面積和保留時(shí)間。結(jié)果顯示，L-丙氨酸異丙酯峰面積的RSD為1.5%，保留時(shí)間的RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性和中間精密度

按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行配制6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果L-丙氨酸異丙酯含量的RSD為2.8%，表明方法重復(fù)性良好。不同分析人員在不同日期重復(fù)上述試驗(yàn)，結(jié)果顯示兩人共12份重復(fù)性供試品溶液中L-丙氨酸異丙酯含量的RSD為2.9%，表明方法中間精密度良好。

2.9 回收試驗(yàn)

精密稱取樣品9 份（批號(hào)：200501），每份約60 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，分別加入一定量對(duì)照品儲(chǔ)備液，制成L-丙氨酸異丙酯濃度相當(dāng)于對(duì)照品溶液的50%、150%、200%的供試品加標(biāo)溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果L-丙氨酸異丙酯的回收率在102.3%～108.3%，RSD均＜2.0%。

2.10 穩(wěn)定性

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液和“2.3.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在10℃條件下放置，分別于0、2、4、6、10 和14 h 進(jìn)樣分析，結(jié)果各溶液中L-丙氨酸異丙酯的峰面積RSD均小于5.5%，表明溶液在10 ℃條件下穩(wěn)定性良好。

2.11 耐用性

改變柱溫、流速和不同型號(hào)色譜柱以考察分析環(huán)境的微小變動(dòng)對(duì)方法的影響，發(fā)現(xiàn)在各個(gè)色譜條件下L-丙氨酸異丙酯的檢測(cè)均不會(huì)受到干擾，方法耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Robustness

2.12 樣品檢測(cè)

分別取3 批富馬酸替諾福韋艾拉酚胺樣品（批號(hào)：200501、200502、200601）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分別為0.044%、0.052%、0.054%，結(jié)果均低于擬訂限度0.10%。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

本研究在前期方法摸索時(shí)分別考察了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.1% 甲酸溶液-乙腈溶液3 種流動(dòng)相。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，水-甲醇體系下L-丙氨酸異丙酯峰形矮胖、響應(yīng)較低，通過(guò)在水相中添加甲酸能夠明顯改善上述問(wèn)題。而在0.1%甲酸溶液-甲醇體系下基線噪音較大，不利于L-丙氨酸異丙酯的檢出。因此，為保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，最終選擇0.1%甲酸溶液-乙腈。

3.2 離子源選擇

在離子源的選擇上，先后比較了電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）兩種常用的離子源。使用APCI 時(shí)發(fā)現(xiàn)L-丙氨酸異丙酯響應(yīng)較低，靈敏度較差；而ESI 可以較好地解決這一問(wèn)題，因此，最終選擇ESI＋為電離方式。

3.3 小結(jié)

本研究建立了液質(zhì)聯(lián)用色譜法檢測(cè)富馬酸替諾福韋艾拉酚胺原料藥中L-丙氨酸異丙酯并完成了相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，該方法可以對(duì)富馬酸替諾福韋艾拉酚胺原料藥中的L-丙氨酸異丙酯進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，可為富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的質(zhì)量研究提供參考，保障藥品質(zhì)量安全。