謝瑩瑩，張悅*，劉雁鳴，趙勇，鄭金鳳，蔣贇，周穎（1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 410001；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室，長沙 410001）

乳酸又名2-羥基丙酸，是一種天然存在的重要有機(jī)酸，作為消毒防腐劑、pH 調(diào)節(jié)劑、助溶劑等，可用于肌內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射、口服糖漿、片劑、外用和陰道用制劑[1-2]。乳酸按其旋光性通?？梢苑譃镈-乳酸、L-乳酸以及外消旋型DL-乳酸3 種，因人體內(nèi)只有L-乳酸脫氫酶可分解自身產(chǎn)生或攝入的L-乳酸，如過量攝入D型、DL型乳酸會產(chǎn)生酸中毒等代謝紊亂癥狀，故醫(yī)藥行業(yè)原輔料只用L-乳酸[3-4]。乳酸在發(fā)酵過程時，伴隨產(chǎn)物乳酸生成的同時還有其他一些有機(jī)酸副產(chǎn)物，有機(jī)酸的含量是評價發(fā)酵工藝的重要指標(biāo)[5-6]。其中《中國藥典》2020年版乳酸品種項下采用化學(xué)反應(yīng)控制枸櫞酸、草酸、磷酸或酒石酸項[7]；日本藥典（JP17.0）對揮發(fā)性脂肪酸進(jìn)行了控制[8]。為明確乳酸中可能含有的有機(jī)酸類型，參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，建立了HPLC-UV 法測定乳酸中其他有機(jī)酸，并采用液質(zhì)聯(lián)用確認(rèn)L-乳酸二聚體的結(jié)構(gòu)，確定該方法可有效排除影響有機(jī)酸分離因素的干擾，具有檢測限低、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可以用于乳酸的質(zhì)量控制，現(xiàn)報道如下。

1 材料

LC-20A 島津高效液相色譜儀（日本島津）；MS105DU 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。草酸（批號：101097-201702，純度：100.0%）、檸檬酸（批號：111679-201602，純度：97.0%）、冰醋酸（批號：190079-202002，純度：99.9%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；酒石酸（批號：20180923）、己二酸（批號：20190407）、磷酸（批號：20200108）對照品（均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；L-乳酸對照品（批號：LRAC 7354，純度：93.3%，Sigma-Alorich 公司）；水為實驗室自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm，9 μm）；流動相：5 mmol·L－1H2SO4；流速：0.6 mL·min－1；檢測波長：210 nm；柱溫：55℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品0.25 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸對照品各適量，加流動相溶解，并逐步稀釋得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（STD1～STD5）（見表1）。

表1 7 種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(mg·mL－1)Tab 1 Standard working solution of 7 substances (mg·mL－1)

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取空白溶液（流動相）、供試品溶液、對照品溶液（STD3），進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，空白溶液對樣品測定無干擾，各成分之間分離度均能達(dá)到藥典要求[11]。典型圖譜見圖1。

圖1 對照品溶液（A）、空白溶液（B）和供試品溶液（C）色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference solution（A），blank solution（B）and test solution（C）

2.4 線性關(guān)系的考察

取“2.2.2”項下的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度對相應(yīng)的峰面積進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系Tab 2 Linearity of various constituents

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下STD3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸峰面積RSD分別為0.23%、0.036%、0.14%、0.11%、0.064%、0.13%、0.52%。

2.6 重復(fù)性試驗

取本品（批號：CD190602C）按“2.2.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果雜質(zhì)僅檢出己二酸，含量為0.22%，RSD為4.7%，L-乳酸含量為64.5%，RSD為0.86%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.6”項下供試品溶液和“2.2.2”項下的STD3 溶液在室溫（25℃）放置0、2、4、6、8、12、24 h 后測定，結(jié)果各成分峰面積的RSD均小于5%，說明供試品及對照品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 定量限、檢測限

取“2.2.2”項下STD1 溶液適量，逐級稀釋，并進(jìn)樣測定，以信噪比S/N＝10 和S/N＝3 時各對照品的量為定量限和檢測限，結(jié)果除主峰（L-乳酸）外，各雜質(zhì)磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、冰醋酸、己二酸檢測限分別為2.7、0.15、2.0、5.2、5.4、7.6 μg·mL－1；定量限分別為9.1、0.50、6.9、17.6、18.2、25.5 μg·mL－1。

2.9 回收試驗

分別稱取本品（批號：CD190602C）適量，精密稱定，置50 mL 量瓶中，分別依次加入磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸對照品各適量，用流動相稀釋并定容至刻度，平行制備6 份；分別精密量取上述溶液各10 μL 進(jìn)樣測定，并計算回收率，結(jié)果磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸的平均回收率分別為103.1%、102.5%、101.5%、100.5%、99.8%、96.2%、101.1%，RSD分別為1.4%、0.80%、1.1%、0.26%、0.59%、0.23%、0.36%。

2.10 耐用性考察

改變柱溫（±5℃）、流速（±0.2 mL·min－1）和不同品牌的液相色譜儀，結(jié)果不同品牌的儀器對結(jié)果無影響；柱溫和流速會影響各組分間的分離，但各組分間的最低分離度均大于1，能夠基本分離，對結(jié)果無明顯影響，表明該方法耐用性較好。

2.11 樣品測定

取33 批乳酸樣品各適量，分別按“2.2.1”項下方法制備，再進(jìn)樣測定，計算樣品中有機(jī)酸含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中的L-乳酸單體及 6 種有機(jī)酸雜質(zhì)檢驗結(jié)果(%)Tab 3 Test results of L-lactic acid monomer and 6 organic acid impurities (%)

2.12 液質(zhì)聯(lián)用確認(rèn)主峰附近峰的結(jié)構(gòu)

2.12.1 液相色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min－1；柱溫：30℃；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脫，程序見表4。

表4 梯度洗脫表Tab 4 Gradient elution

2.12.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；源電壓4 kV；氮?dú)饬魉伲? L·min－1；加熱氣流速：10 L·min－1；干燥器氣流速：10 L·min－1；接口溫度：300℃；離子傳輸管溫度：250℃；加熱模塊溫度：400 ℃，負(fù)離子模式；一級質(zhì)譜掃描范圍50～1000；二級質(zhì)譜碰撞電壓：15 eV。

2.12.3 供試品的制備 單獨(dú)收集圖1中供試品溶液的峰8 組分，作為供試品溶液。

2.12.4L-乳酸對照品溶液 取L-乳酸對照品10 mg，加水溶解并稀釋成1 μg·mL－1的溶液，即得。

2.12.5 碎片離子確認(rèn) 精密量取供試品溶液、L-乳酸對照品溶液各3 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果顯示，峰8 母離子一級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了m/z161.15，推測峰8 可能為兩個乳酸分子聚合，脫去一分子水，生成乳酸二聚體，分子量為162，在負(fù)離子模式下[M-H]－為161。峰8 母離子經(jīng)碰撞室碰撞后生成了m/z89.45 的碎片離子，即為L-乳酸的碎片離子，證實峰8 為乳酸二聚體。

3 討論

3.1 檢測器的選擇

有文獻(xiàn)[12]提出有機(jī)酸的檢測可采用示差檢測器，故課題組對該文獻(xiàn)方法進(jìn)行優(yōu)化，使各成分分離能基本達(dá)到《中國藥典》2020年版四部通則0512分離度的要求后，采用同一混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在示差檢測器和紫外檢測器上進(jìn)行測定，結(jié)果7 個成分在示差檢測器上的檢測限明顯高于紫外檢測器，且示差檢測器影響因素多，所以選擇紫外檢測器進(jìn)行檢測。

3.2 檢測波長的選擇

對6 種有機(jī)酸雜質(zhì)及L-乳酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長全掃描，發(fā)現(xiàn)各成分在210 nm 附近均有最大吸收，所以選取210 nm 作為檢測波長。

3.3 結(jié)論

該方法不僅可檢測出乳酸中6 種有機(jī)酸雜質(zhì)，還可將L-乳酸單體及L-乳酸二聚體區(qū)分開來，而《中國藥典》2020年版乳酸品種項下[7]的含量測定采用滴定法，其原理是用過量氫氧化鈉將乳酸中聚合體水解成乳酸單體后，再用硫酸滴定液返滴定，測定的是樣品中乳酸及其聚合體的總和，不能反映樣品中乳酸單體的含量；乳酸在高濃度下會發(fā)生聚合反應(yīng)，生成乳酸聚合體[13]，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對乳酸的定義相吻合，因此該方法測定L-乳酸單體含量相比于滴定法專屬性更強(qiáng)。

4 小結(jié)

本研究建立了一種可有效檢測乳酸中L-乳酸單體及6 種有機(jī)酸雜質(zhì)的高效液相色譜法，該方法簡便、準(zhǔn)確，可有效分離各有機(jī)酸雜質(zhì)并應(yīng)用于乳酸中L-乳酸單體的批量檢測，為乳酸標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和質(zhì)量可控性提供參考。