張容華，楊放，鄭艾妮，鮑穎霞，賴燁才，余華，陳綺玲，王健松*（1.廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠，廣州 510515；2.廣東省化學(xué)藥原料與制劑關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510515；.澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門 999078）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，以記憶和認(rèn)知能力的進(jìn)行性減退為主要臨床特征[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球AD 患者已超過(guò)5000 萬(wàn)人，預(yù)計(jì)2050年將突破1.52 億人[2-3]。我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)，預(yù)計(jì)到2050年，我國(guó)AD 患病人數(shù)超過(guò)3000 萬(wàn)，是新發(fā)病例全球增速最快的國(guó)家之一[4-5]。而現(xiàn)有藥物主要是改善或延緩癥狀，對(duì)初期和中期患者起治療作用，維持患者認(rèn)知狀態(tài)[6-10]。LW33 是由我公司與中山大學(xué)聯(lián)合開發(fā)的磷酸二酯酶9A（PDE9A）抑制劑，為一類創(chuàng)新藥，其結(jié)構(gòu)式見圖1。磷酸二酯酶（PDE）抑制劑能夠有效抑制PDE 對(duì)于環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和/或環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的降解，使得人體與認(rèn)知相關(guān)的生理功能得以正常表達(dá)，因此PDE 抑制劑可用于治療學(xué)習(xí)記憶障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11-16]。LW33 具有良好的類藥性、成藥性特征和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，是高效價(jià)、多靶點(diǎn)抗AD 的候選藥物[17]。

圖1 LW33 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure formula of LW33

LW33 作為一個(gè)非常有潛力的候選藥物，其有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法在國(guó)內(nèi)外均未有報(bào)道，本文建立了檢測(cè)LW33有關(guān)物質(zhì)的HPLC 法和UPLC 法，兩種方法學(xué)經(jīng)驗(yàn)證均符合要求，且UPLC 法分析快速，節(jié)省溶劑，適用于快速檢測(cè)LW33 中的有關(guān)物質(zhì)，提高研發(fā)的效率。

1 材料

Waters Acquity UPLC 液相色譜儀（包括Quaternary Solvent Manager 四元溶劑管理器，Sample Manager-FIN 樣品管理器，二極管陣列檢測(cè)器PDA，美國(guó)Waters 公司）；Waters Alliance e2695液相色譜儀（包括Separations Module，2998 二極管陣列檢測(cè)器PDA，美國(guó)Waters 公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；P30H 超聲波清洗器（德國(guó)Elma 公司）。

對(duì)照品LW33（批號(hào)：ZS1904001，含量：97.55%，自制標(biāo)定），雜質(zhì)A 對(duì)照品（批號(hào)：ZS1904001，含量：96.41%，自制標(biāo)定），雜質(zhì)B 對(duì)照品（批號(hào)：ZS1904001，含量：98.75%，自制標(biāo)定）。甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司），冰醋酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠），超純水（Milli-Q 制備）。3 批LW33 原料供試品（批號(hào)：ZS1904001、ZS1904002、ZS1904003，廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜條件（UPLC） 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速為0.21 mL·min－1；進(jìn)樣量1 μL；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為 257 nm；流動(dòng)相系統(tǒng)為水溶液（用冰醋酸調(diào)pH 值至3.0）（A）-甲醇（B）；梯度洗脫程序如下：0～12 min，70%～90%B；12～14 min，90%～70%B；14～16 min，70%B。

2.1.2 色譜條件（HPLC） 色譜柱為SHISEIDO CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速為1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為 257 nm；流動(dòng)相系統(tǒng)為水溶液（用冰醋酸調(diào)pH 值至3.0）（A）-甲醇（B）；梯度洗脫程序如下：0～30 min，70%～90%B；30～35 min，

90%～70%B；35～40 min，70%B。

2.2 溶液的制備

2.2.1 溶劑的制備 取流動(dòng)相A 與流動(dòng)相B 按比例30∶70（v/v）混合制成。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取LW33和雜質(zhì)B 適量，置于同一量瓶中，加溶劑超聲溶解，放冷，并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為約75、35 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，精密稱定，加溶劑超聲溶解，放冷，并稀釋制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL－1的溶液。

2.2.4 自身對(duì)照溶液的制備 精密量取供試品溶液0.5 mL，置50 mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液的制備 精密稱取LW33對(duì)照品、雜質(zhì)A 對(duì)照品和雜質(zhì)B 對(duì)照品適量，加溶劑超聲溶解，放冷，并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為約1、0.01、0.01 mg·mL－1的溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件（HPLC），分別取空白溶劑、供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，色譜圖見圖2。結(jié)果表明，空白溶劑均無(wú)干擾。

圖2 專屬性色譜圖Fig 2 Chromatograms of specificity

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.5”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液，分別在“2.1.1”項(xiàng)的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)的色譜條件（HPLC）下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，色譜圖見圖3。結(jié)果表明，在UPLC 和HPLC 系統(tǒng)下，主成分峰與相鄰雜質(zhì)A 峰的分離度分別為2.5 和3.0，系統(tǒng)適用性均符合要求。

圖3 系統(tǒng)適用性色譜圖Fig 3 Chromatograms of system applicability

2.5 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

取LW33 分別用2 mol·L－1鹽酸溶液、2 mol·L－1氫氧化鈉溶液、30%過(guò)氧化氫溶液、高溫60 ℃、高濕92.5%等進(jìn)行降解試驗(yàn)。按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件（HPLC），進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在所有強(qiáng)制降解條件下，空白溶劑均不影響雜質(zhì)檢測(cè)，降解產(chǎn)物與主峰的分離度均符合要求，主峰純度角均小于純度閾值，各強(qiáng)制降解條件前后的物料平衡在90%～110%，均符合要求。兩種方法測(cè)得的雜質(zhì)譜相似，降解試驗(yàn)色譜圖見圖4、5。

圖4 強(qiáng)制降解試驗(yàn)UPLC 色譜圖Fig 4 UPLC chromatograms of forced degradation test

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測(cè)限

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，用溶劑稀釋為一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件（HPLC）檢測(cè)，以化合物的峰面積為縱坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果顯示，LW33 在1.568～31.36 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好；雜質(zhì)B 在0.7094～14.19μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。在UPLC 系統(tǒng)和HPLC 系統(tǒng)下，線性關(guān)系均符合要求。

另取混合對(duì)照品溶液稀釋，分別進(jìn)樣分析，取信噪比值為10（S/N＝10）的質(zhì)量濃度為定量限（LOQs），S/N＝3 的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限（LODs）。結(jié)果見表1，靈敏度均符合要求。

表1 LW33 和雜質(zhì)B 的回歸方程、定量限和檢測(cè)限Tab 1 Regression equation，LOQs and LODs of LW33 and impurity B

2.7 重復(fù)性

按“2.2.3”和“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液及自身對(duì)照溶液，分別在 “2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件（HPLC）下進(jìn)樣分析，以雜質(zhì)含量的RSD考察。結(jié)果表明，在UPLC 系統(tǒng)下，雜質(zhì)B 含量的RSD為12%，其他最大單個(gè)雜質(zhì)含量的RSD為0.0%，總雜質(zhì)量的RSD為3.8%；在HPLC 系統(tǒng)下，雜質(zhì)B 含量的RSD為0.0%，其他最大單個(gè)雜質(zhì)含量的RSD均為2.6%，總雜質(zhì)量的RSD為1.8%。在UPLC 系統(tǒng)和HPLC 系統(tǒng)下，6 份供試品雜質(zhì)含量的RSD均不大于15%，重復(fù)性符合要求。

2.8 中間精密度

取“2.7”重復(fù)性項(xiàng)下供試品溶液及自身對(duì)照溶液，分別在“2.1.1”項(xiàng)的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)的色譜條件（HPLC）下進(jìn)行樣品檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在UPLC 系統(tǒng)下，雜質(zhì)B 含量的RSD為12%，其他最大單個(gè)雜質(zhì)含量的RSD為0.0%，總雜質(zhì)量的RSD為3.8%；在HPLC系統(tǒng)下，雜質(zhì)B 含量的RSD為0.0%，其他最大單個(gè)雜質(zhì)含量的RSD為2.6%，總雜質(zhì)量的RSD為1.8%。12 個(gè)雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)中，雜質(zhì)B 含量的RSD為9.5%，其他最大單個(gè)雜質(zhì)含量的RSD為10%，總雜質(zhì)量的RSD為12%，12 個(gè)雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)的RSD均不大于20%，精密度符合要求。

2.9 準(zhǔn)確度

稱取LW33 共9 份，置于25 mL 量瓶中，分別加入已知量的雜質(zhì)B 對(duì)照品溶液，相當(dāng)于雜質(zhì)限度的15%、100%、200%水平的溶液。分別精密量取空白溶劑、本底溶液、上述各加標(biāo)供試品溶液及自身對(duì)照溶液，在“2.1.1”項(xiàng)的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)的色譜條件（HPLC）下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，考察平均回收率和RSD。結(jié)果表明，在UPLC 系統(tǒng)下，雜質(zhì)B 低、中、高質(zhì)量濃度的平均回收率分別為107.6%、104.1%、103.0%，RSD分別為2.1%、1.5%、1.9%； 在HPLC 系統(tǒng)下，雜質(zhì)B 低、中、高質(zhì)量濃度的平均回收率分別為101.7%、101.8%、99.3%，RSD分別為0.78%、0.27%、0.87%。在UPLC 系統(tǒng)和HPLC 系統(tǒng)下，準(zhǔn)確度符合要求。

2.10 穩(wěn)定性

圖5 強(qiáng)制降解試驗(yàn)HPLC 色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms of forced degradation test

取“2.7”項(xiàng)下供試品溶液及自身對(duì)照溶液在室溫下放置24 h，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件（UPLC），分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析。結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 樣品的檢測(cè)

取3 批樣品（批號(hào)：ZS1904001，ZS1904002，ZS1904003）按“2.2.3”項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)的色譜條件（UPLC）和“2.1.2”項(xiàng)的色譜條件（HPLC）下進(jìn)樣分析，記錄化合物峰面積。有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果見表2。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果(%)Tab 2 Sample detection (%)

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)首先優(yōu)化了流動(dòng)相系統(tǒng)。在純水-甲醇流動(dòng)相系統(tǒng)中，色譜峰峰形不夠理想。因此在水相中加入冰醋酸，結(jié)果顯示，峰形和分離度均有較好的改善。其次篩選適用HPLC 系統(tǒng)的色譜柱，分別采用了Luna C18（2）100A（4.6 mm×250mm，5 μm）和SHISEIDO CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，系統(tǒng)適用性溶液的進(jìn)樣結(jié)果顯示，Luna C18 色譜柱未達(dá)基線分離的要求，而SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱則能達(dá)到基線分離的要求。之后進(jìn)行波長(zhǎng)優(yōu)化，采用PDA 檢測(cè)器得到LW33 和雜質(zhì)A、B的紫外吸收?qǐng)D，試驗(yàn)結(jié)果顯示最大或較大吸收波長(zhǎng)分布在216～220 nm 以及256～271 nm。因甲醇截止波長(zhǎng)為210 nm，綜合考慮為使LW33 和各雜質(zhì)均處于較大吸收范圍，同時(shí)避免溶劑末端吸收效應(yīng)，故選用主成分最大吸收波長(zhǎng)257 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。最后進(jìn)行供試品溶劑的篩選，為避免溶劑效應(yīng)，供試品溶劑選擇水（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-甲醇（30∶70）。

3.2 方法的對(duì)比

本研究中UPLC 和HPLC 兩種方法的準(zhǔn)確度、精密度、線性等方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果基本一致，雜質(zhì)譜相似，可以互相替代。由系統(tǒng)適用性色譜圖可見，雜質(zhì)A 緊鄰主峰，在HPLC 色譜圖中，雜質(zhì)A 位于主峰后；在UPLC 色譜圖中，雜質(zhì)A 位于主峰前。分析出峰順序變化的原因：雜質(zhì)A 的極性與主成分的極性較為接近，兩者與固定相之間作用力的少許差別會(huì)影響它們?cè)谏V柱上的保留。盡管本研究中HPLC 與UPLC 兩種色譜柱的填料類型均為十八烷基硅烷鍵合硅膠，但是為不同的品牌。通常，不同品牌甚至同一品牌的不同系列色譜柱，會(huì)采用不同的硅膠基質(zhì)、鍵合技術(shù)和封端技術(shù)，其疏水作用、空間位阻、氫鍵作用、靜電作用等能力的差異，使各色譜柱表現(xiàn)出不一樣的選擇性[18]。

HPLC 具有普遍適用性，但分析時(shí)間長(zhǎng)，且與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)需分流。與之相比，UPLC 具有分析時(shí)間短，溶劑需要量較少，分離度好，靈敏度高，質(zhì)譜接口良好的優(yōu)點(diǎn)；但同時(shí)在分析應(yīng)用上仍存在儀器相對(duì)貴，樣品前處理要求嚴(yán)格，峰面積重現(xiàn)性相對(duì)稍差，市場(chǎng)所供應(yīng)的不同分離機(jī)制的小顆粒填料的色譜柱較少等缺點(diǎn)[19]。

在一類新藥LW33 研發(fā)的過(guò)程中，我們先開發(fā)的是普通的HPLC 法，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，在實(shí)際應(yīng)用中，該方法不僅要用于最終成品的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，還用于合成工藝中的中間體控制、工藝優(yōu)化中的雜質(zhì)對(duì)比等過(guò)程，工作量較大，為了提高檢測(cè)的及時(shí)性和研發(fā)效率，進(jìn)一步開發(fā)了UPLC 法，在以上UPLC 具備的眾多優(yōu)點(diǎn)中，分析時(shí)間是首要考慮的因素。與HPLC 法相比，UPLC 法縮短了一半以上的運(yùn)行時(shí)間，溶劑使用量?jī)H為HPLC 法的1/10，提高了效率，節(jié)省溶劑；且UPLC 可直接與質(zhì)譜聯(lián)用，無(wú)需分流，為雜質(zhì)的后續(xù)研究提供極大方便[20]。