李金堯，王雅夢(mèng)，雷霞，趙晨宇，董曉紅，劉國(guó)良，張寧，*，劉斌*（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 50040；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 54007）

補(bǔ)陽(yáng)還五湯（BYHWD）為傳統(tǒng)中藥方劑，由生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、通經(jīng)活絡(luò)的作用，臨床上常用于治療血管性癡呆、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病[1-2]。有研究表明，BYHWD 對(duì)阿爾茨海默病（AD）也具有良好的治療效果，但其作用機(jī)制尚不明確[3-4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物數(shù)據(jù)庫(kù)及組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，融合多學(xué)科原理和技術(shù)，可以預(yù)測(cè)參與機(jī)體生物學(xué)過(guò)程的作用靶點(diǎn)和通路途徑，為揭示中醫(yī)藥療效的多靶點(diǎn)機(jī)制研究提供新的方法和思路[5]。Qu 等[6]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以降低血腦屏障（BBB）的通透性，減少外周有毒物質(zhì)進(jìn)入大腦，保護(hù)神經(jīng)元。因此推測(cè)BYHWD 的神經(jīng)保護(hù)作用可能與BBB 有關(guān)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)BYHWD 治療AD 的作用機(jī)制，并用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，探討B(tài)YHWD如何達(dá)到治療AD 的效果。

1 材料

1.1 儀器與試藥

新物體識(shí)別設(shè)備（貨號(hào)：RD1121-NR-M）、避暗設(shè)備（貨號(hào)：RD1106-SB-M）（上海移數(shù)）；光學(xué)顯微鏡（貨號(hào)：IX-71-21PH，奧林巴斯）；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（貨號(hào)：RM2016，德國(guó)LEICA）。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號(hào)：C0105S，碧云天生物技術(shù)）；兔抗-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）多克隆抗體（貨號(hào)：125422）、兔抗-低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）多克隆抗體（貨號(hào)：124368）、兔抗-血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）多克隆抗體（貨號(hào)：11989）、兔抗-載脂蛋白E（ApoE）多克隆抗體（貨號(hào)：119748）（愛(ài)必信）；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（貨號(hào)：PV-6001，中杉金橋）；山羊血清（貨號(hào)：SL038，北京Solarbio）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（貨號(hào)：W026，南京建成）；鹽酸多奈哌齊（貨號(hào)：S60449，源葉生物）；生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花均購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心田明教授鑒定生黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根，當(dāng)歸尾為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHor 的干燥根莖，地龍為巨蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥體，桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 的干燥成熟種子，紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。取生黃芪1200 g、當(dāng)歸尾60 g、赤芍45 g、川芎30 g、地龍30 g、桃仁30 g、紅花30 g 制備成BYHWD 水煎劑，經(jīng)冷凍干燥制為干粉，出粉率是34.11%，得到干粉486 g，于4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠和SPF 級(jí)C57BL/6J小鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2015-0001 號(hào)]，雄性，7月齡，體質(zhì)量為（40±10）g。于無(wú)菌環(huán)境飼養(yǎng)，溫度保持在（21±1）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//herb.ac.cn/），UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swissadme.ch/），SwissTarget-Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/），TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/），OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/），DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/），HPO 數(shù)據(jù) 庫(kù)（https：//hpo.jax.org/），STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/），Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/gp/index.html），Cytoscape 3.7.2 軟件。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 BYHWD 成分收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 運(yùn)用TCMSP、HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花的化學(xué)成分信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)篩選有效成分和作用靶點(diǎn)。由于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄地龍，HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)化學(xué)成分信息較少，其化學(xué)成分信息通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得，在SwissADME 平臺(tái)以可透過(guò)BBB、胃腸道吸收活性高、“Druglikeness”項(xiàng)有兩個(gè)及以上“Yes”為標(biāo)準(zhǔn)篩選有效成分，通過(guò)SwissTargetPrediction 平臺(tái)預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)校正為官方基因名。共收集到 BYHWD 活性成分118 個(gè)，其中黃芪20 個(gè)、當(dāng)歸2 個(gè)、赤芍29 個(gè)、川芎7 個(gè)、桃仁23 個(gè)、紅花22 個(gè)、地龍15 個(gè)，刪除重復(fù)值后得到744 個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.1.2 AD 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 分別登錄TTD、OMIM、DisGeNET、HPO 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞搜索AD 的作用靶點(diǎn)，將四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)整合取交集，并用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)校正為官方基因名，最終整理出1607 個(gè)AD 作用靶點(diǎn)。

2.1.3 BYHWD 抗AD 潛在靶點(diǎn)的篩選 將BYHWD 的作用靶點(diǎn)和AD 作用靶點(diǎn)分別錄進(jìn)Venny 作圖工具，取交集，得到163 個(gè)BYHWD抗AD 的潛在作用靶點(diǎn)，潛在作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)BYHWD 的89 個(gè)活性成分。

2.1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)，將蛋白種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，其余設(shè)置默認(rèn)，進(jìn)行 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析，利用Cytoscape 3.7.2 可視化處理，見(jiàn)圖1。如圖1所示，該交互網(wǎng)絡(luò)中有163 個(gè)節(jié)點(diǎn)和2103個(gè)連線（顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大表示連接度越高）。

圖1 BYHWD 抗AD 作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 1 PPI network of anti-AD targets of BYHWD

2.1.5 “組方藥材-活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件將7 個(gè)組方藥材、89 個(gè)活性成分、163 個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建組方藥材-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2（顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大表示節(jié)點(diǎn)越重要）。

圖2 組方藥材-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Medicinal material-active ingredient-disease target network

2.1.6 GO 及KEGG 富集分析 將潛在作用靶點(diǎn)輸入Metascape 基因富集在線工具，限定物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析，以P＜0.05 篩選排名前10 的信息作GO 柱狀圖和KEGG 氣泡圖，借助微生信平臺(tái)將其可視化。GO 富集結(jié)果表示，生物過(guò)程主要涵蓋激酶活性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、MAPK 級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分主要包括樹(shù)突、樹(shù)突樹(shù)、突觸后膜等；分子功能主要涉及蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性等（見(jiàn)圖3）。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)癌癥、AD、膽固醇代謝、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號(hào)通路等與AD 密切相關(guān)（見(jiàn)圖4）。

圖3 GO 富集分析結(jié)果Fig 3 GO enrichment analysis

圖4 KEGG 富集分析結(jié)果Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6 組，20 只C57BL/6J 小鼠作為對(duì)照組，APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠按照每組20 只，隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性藥多奈哌齊組，BYHWD 高劑量、中劑量和低劑量組。模型組和對(duì)照組每日灌胃同樣體積的生理鹽水，多奈哌齊組小鼠灌胃0.001 g/（kg·d）劑量的多奈哌齊，BYHWD 高劑量、中劑量和低劑量組分別灌胃37.06、18.53、9.26 g/（kg·d）劑量的BYHWD（生藥量），灌胃持續(xù)35 d。

2.2.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 將兩個(gè)完全相同的物體放置在曠場(chǎng)箱內(nèi)，距離為25 cm，放入小鼠讓其自由探索10 min，取出，將其中一個(gè)物體替換為不同顏色、形狀和材質(zhì)的新物體。讓小鼠休息5 h后，再放在與上次一樣的位置，自由移動(dòng)10 min。記下對(duì)新鮮物體的探索時(shí)間（Tn）和熟悉物體的探索時(shí)間（Tf），用識(shí)別指數(shù)（Ti）[Ti＝Tn/（Tn＋Tf）×100%]表示小鼠對(duì)物體識(shí)別的能力，結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的新物體識(shí)別指數(shù)下降（P＜0.001）；與模型組相比，BYHWD各劑量組新物體識(shí)別指數(shù)上升（P＜0.001）。

表1 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of BYHWD on novel object recognition experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表1 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of BYHWD on novel object recognition experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

組別識(shí)別指數(shù)/%對(duì)照組37.59±2.15模型組14.94±2.29***多奈哌齊組29.73±1.89###BYHWD 高劑量組32.47±2.02###BYHWD 中劑量組31.39±1.78###BYHWD 低劑量組25.10±1.68###

2.2.3 避暗實(shí)驗(yàn) 訓(xùn)練前將小鼠背向洞口放置于明室，適應(yīng)2 min 后，暗室通40 V 電流，記錄下每只小鼠潛伏期（即小鼠第一次進(jìn)入暗室的時(shí)間）。每次訓(xùn)練5 min，每日訓(xùn)練3 次，連續(xù)訓(xùn)練2 d 以改善小鼠的避暗行為。若小鼠在5 min 內(nèi)沒(méi)有入洞，則棄去。24 h 后開(kāi)始測(cè)試，記錄小鼠的避暗潛伏期和5 min 內(nèi)的進(jìn)入次數(shù)（即錯(cuò)誤次數(shù)）。結(jié)果見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，模型組小鼠避暗潛伏期減短，錯(cuò)誤次數(shù)增多（P＜0.001）；與模型組相比，BYHWD 各劑量組避暗潛伏期增長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)減少（P＜0.001）。

表2 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of BYHWD on dark avoidance experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表2 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of BYHWD on dark avoidance experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

注：與對(duì)照組相比，***P＜0.001；與模型組相比，###P＜0.001。Note：Compared with the control group，***P＜0.001；compared with the model group，###P＜0.001.

組別避暗潛伏期/s錯(cuò)誤次數(shù)對(duì)照組263.43±14.551.15±0.32模型組124.00±20.11***2.80±0.48***多奈哌齊組234.54±20.20###1.61±0.31###BYHWD 高劑量組228.17±17.10###1.68±0.30###BYHWD 中劑量組220.35±17.34###1.78±0.20###BYHWD 低劑量組212.72±17.26###1.79±0.27###

2.2.4 HE 染色 取出海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇及二甲苯脫水，每步15～20 min，石蠟包埋備用。切片后用蘇木素-伊紅進(jìn)行染色、封片，在顯微鏡下觀察小鼠海馬的病理學(xué)改變，結(jié)果見(jiàn)圖5。對(duì)照組小鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞體積較大，結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻。模型組CA1 區(qū)細(xì)胞數(shù)量少，體積小，胞質(zhì)不豐富，可見(jiàn)空泡類(lèi)物質(zhì)。多奈哌齊組細(xì)胞與模型組相比數(shù)量較多，排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰。BYHWD 高劑量組CA1 區(qū)細(xì)胞數(shù)量多，體積大，結(jié)構(gòu)清晰；BYHWD 中劑量組CA1 區(qū)細(xì)胞略多，體積略大，結(jié)構(gòu)清晰；BYHWD 低劑量組CA1區(qū)細(xì)胞排列分散無(wú)序，結(jié)構(gòu)不清晰。

圖5 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠海馬形態(tài)的影響（×400）Fig 5 Effect of BYHWD on the hippocampal morphology in the APP/PS1 mice（×400）

2.2.5 IHC 法 取海馬組織切片進(jìn)行脫蠟、脫水，抗原修復(fù)后用3%H2O2孵育10 min，PBS 清洗3 次；滴加血清封閉20 min，棄去血清；加入50 μL PBS稀釋過(guò)的一抗（1∶300），室溫靜置1 h，PBS 清洗3 次；滴加50 μL 二抗（1∶500），室溫靜置30 min，PBS 清洗3 次；DAB 顯色5～10 min，流水沖洗終止顯色；蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡觀察海馬區(qū)RAGE、LRP1、ApoE 和VCAM-1陽(yáng)性細(xì)胞，利用取上不取下的方法對(duì)壓邊線的細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3及圖6，與對(duì)照組相比，模型組LRP1、ApoE 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)降低，RAGE、VCAM-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組相比，BYHWD 各劑量組LRP1、ApoE 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)增加，RAGE、VCAM-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)顯著降低（P＜0.001）。

圖6 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠海馬RAGE、LRP1、ApoE、VCAM-1 蛋白表達(dá)的影響（×400）Fig 6 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of the APP/PS1 mice（×400）

表3 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠海馬RAGE、LRP1、ApoE 及VCAM-1 表達(dá)的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表3 BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠海馬RAGE、LRP1、ApoE 及VCAM-1 表達(dá)的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of APP/PS1 mice (±s，n＝10)

注：與對(duì)照組相比，***P＜0.001；與模型組相比，###P＜0.001。Note：Compared with the control group，***P＜0.001；compared with the model group，###P＜0.001.

組別RAGELRP1ApoEVCAM-1對(duì)照組22.75±1.4586.86±3.3742.55±3.20 48.29±10.59模型組48.79±3.11***12.39±1.05*** 8.72±1.94***363.30±5.28***多奈哌齊組26.03±2.35###67.80±4.04###33.58±1.91###123.50±1.20###BYHWD 高劑量組24.03±1.04###48.74±3.17###25.03±2.57### 64.51±2.48###BYHWD 中劑量組34.07±3.48###25.56±2.13###18.54±1.82###182.90±10.90###BYHWD 低劑量組32.83±2.36###35.36±0.57###15.05±1.39###234.60±25.50###

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0 分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

氣虛血瘀，腦絡(luò)瘀阻，腦失濡養(yǎng)是AD 發(fā)生發(fā)展的重要病機(jī)，與之相適應(yīng)，益氣活血通絡(luò)為其主要治則[7]。BYHWD 中君藥黃芪補(bǔ)氣行血，臣藥當(dāng)歸活血祛瘀，佐以赤芍、川芎、桃仁、紅花助當(dāng)歸活血化瘀，地龍通經(jīng)活絡(luò)，全方共奏補(bǔ)氣、活血、化瘀通絡(luò)之效。已有研究證實(shí)BYHWD 對(duì)AD 有很好的作用[3-4]，但作用機(jī)制尚不明確。而祛瘀通絡(luò)藥可以通過(guò)改善BBB 對(duì)腦源性疾病進(jìn)行治療[8]。BYHWD 作為祛瘀通絡(luò)藥，很有可能通過(guò)改善BBB 治療AD，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究BYHWD 治療AD 的作用機(jī)制。

與前期BYHWD 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究相比[9]，本文補(bǔ)充了AD 靶點(diǎn)，通過(guò)文獻(xiàn)檢索等方法豐富了組方藥材的活性成分及作用靶點(diǎn)，將BYHWD 抗AD 的潛在靶點(diǎn)由33 個(gè)豐富至163 個(gè)。KEGG 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)BYHWD 主要通過(guò)AD、膽固醇代謝、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE 等信號(hào)通路治療AD。潛在核心靶點(diǎn)VCAM-1、ApoE 與這些通路密切相關(guān)。AD 通路中VCAM-1、ApoE 的上游，RAGE/LRP1 轉(zhuǎn)運(yùn)體已被證實(shí)可以介導(dǎo) Aβ跨BBB 轉(zhuǎn)運(yùn)，RAGE 介導(dǎo) Aβ的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)，LRP1 介導(dǎo) Aβ的外排轉(zhuǎn)運(yùn)[10]，這與前期猜想一致，說(shuō)明BYHWD 可通過(guò)改善BBB 達(dá)到治療AD 的作用。

目前，AD 的主要病理特征是腦內(nèi)Aβ異常沉積形成的老年斑和tau 蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，中樞Aβ含量是核心發(fā)病因素。VCAM-1 是RAGE 的配體[11]，為可誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子，研究證實(shí)AD 患者RAGE 水平升高，Aβ內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，Aβ過(guò)渡沉積可刺激VCAM-1 表達(dá)，其表達(dá)水平還與炎癥細(xì)胞因子相關(guān)[12-13]。ApoE 是LRP1 的配體，可與 Aβ結(jié)合成復(fù)合物，通過(guò)BBB 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入外周血液或被溶酶體吞噬降解[14-15]。高度脂化的ApoE 可以大幅增強(qiáng)與Aβ的親和性，從而促進(jìn)胰島素降解酶對(duì)Aβ的降解能力，有效清除腦內(nèi)Aβ。

本文利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BYHWD 給藥后RAGE、LRP1、ApoE、VCAM-1 的表達(dá)水平，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步探究BYHWD 是否通過(guò)調(diào)節(jié)RAGE/LRP1 轉(zhuǎn)運(yùn)體，改善BBB 轉(zhuǎn)運(yùn)異常，發(fā)揮抗AD 的作用。

基于APP/PS1 小鼠的特點(diǎn)，該動(dòng)物模型適用于藥物對(duì)AD 預(yù)防及治療的基礎(chǔ)性研究[16]。學(xué)習(xí)和記憶障礙是AD 早期出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)[17]，且貫穿于整個(gè)疾病過(guò)程中，本文根據(jù)學(xué)習(xí)記憶障礙的改善情況來(lái)評(píng)價(jià)BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠的治療效果。與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的主要區(qū)域位于海馬區(qū)，海馬區(qū)對(duì)于情緒記憶方面也具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，隨著海馬區(qū)損毀程度加大，空間學(xué)習(xí)記憶能力會(huì)不斷下降直至喪失，而且對(duì)于情緒記憶的能力也隨之下降[18-19]。故本文先通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給藥后APP/PS1 小鼠的新物體識(shí)別指數(shù)得到改善，避暗潛伏期上升，錯(cuò)誤次數(shù)下降，表明BYHWD 可改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。又利用HE 染色觀察海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，從形態(tài)學(xué)角度再次驗(yàn)證BYHWD 對(duì)APP/PS1 小鼠的治療效果。IHC 結(jié)果表明，經(jīng)BYHWD 干預(yù)后，海馬LRP1、ApoE 表達(dá)水平上調(diào)，RAGE、VCAM-1 表達(dá)水平下調(diào)，證明BYHWD 可通過(guò)調(diào)節(jié)RAGE/LRP1 轉(zhuǎn)運(yùn)體，改善APP/PS1 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上，本文根據(jù)BYHWD 傳統(tǒng)功效猜測(cè)其可能通過(guò)改善BBB 治療AD，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出BYHWD 抗AD 潛在核心靶點(diǎn)VCAM-1、ApoE，研究證明它們的上游——RAGE/LRP1 轉(zhuǎn)運(yùn)體已明確可以介導(dǎo) Aβ跨BBB 轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BYHWD 給藥后可以改善APP/PS1 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，治療機(jī)制與調(diào)節(jié)RAGE/LRP1 轉(zhuǎn)運(yùn)體關(guān)鍵蛋白表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)，即上調(diào)LRP1、ApoE，下調(diào)RAGE、VCAM-1，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)及前期猜想。本研究為BYHWD 治療AD 提供了理論基礎(chǔ)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。