郝昱，王璐，郝怡萌，張晴，劉冰倩，王莉?qū)帲ㄌ旖蛑嗅t(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617）

環(huán)裂松蘿Usnea diffracta是一種具有較高藥用價(jià)值的地衣類中藥[1]，隸屬于地衣門松蘿科松蘿屬，主要分布在中國內(nèi)蒙古、吉林、四川等地[2]?！度珖胁菟巺R編》記載其性平，味甘，歸心、腎、肺經(jīng)，具有清熱解毒、清肝明目、止咳化痰、舒筋活血等功效[3-4]。其主要化學(xué)成分包括縮酚酸類、多取代單苯環(huán)類、二苯并呋喃類、脂肪酸類以及其他類[5]，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗炎等藥理活性[6-7]。環(huán)裂松蘿具有廣譜抗菌活性[7]，且不易導(dǎo)致耐藥[8]。本文對環(huán)裂松蘿的化學(xué)成分進(jìn)行分離（見圖1），通過體外實(shí)驗(yàn)初步篩選抗金黃色葡萄球菌的活性成分，并通過分子對接CDOCKER 虛擬篩選抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的活性成分。

圖1 化合物1～15 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structures of compounds 1－15

1 儀器與試藥

Bruker AVANCE III600 MHz/500 MHz 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Waters Xevo G2-SUPLC-Q/TOF-MS（美國Waters）；島津LC-20AP 制備型高效液相色譜儀（日本島津）；ZHJHC1112B 超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；HNYC-2102C 恒溫培養(yǎng)震蕩器（天津歐諾儀器儀表有限公司）；YXQ-LS-75S11 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；GENESYS 10S 紫外-可見分光光度計(jì)（美國ThermoFisher Scientific 公司）；BHI 腦心浸液肉湯、BHI 腦心浸液瓊脂（青島海博生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（上海晶純生化科技股份有限公司）；200～300 目柱層析硅膠及薄層硅膠板GF-254（青島海洋化工有限公司）；Sephadex-LH-20（Pharmacia生物技術(shù)有限公司）；AB-8 大孔吸附樹脂（天津賽智維科技有限公司）；柱層析ODS、YMC-pack-A（5 μm，10 mm×250 mm）半制備型色譜柱（日本YMC 公司）；色譜級甲醇、乙腈，分析級石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、甲酸（天津市康科德科技有限公司）；水（杭州娃哈哈公司）。

藥材于2018年在保定安國中藥材市場購買，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張麗娟教授鑒定其為松蘿科松蘿屬植物環(huán)裂松蘿Usnea diffracta的干燥地衣體。藥材標(biāo)本（編號：UD-2018-C412-1）存放于天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 提取與分離

取粉碎后的干燥環(huán)裂松蘿地衣體（4.0 kg），用95%乙醇加熱回流提取3 次，合并濃縮得1.7 kg 浸膏。將浸膏制成水混懸液后分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。水層經(jīng)大孔樹脂（乙醇-水分別為30∶70，60∶40，100∶0）依次洗脫，得到相應(yīng)部位浸膏。取石油醚部位浸膏2.0 g 經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯分別為100∶1，14∶1，7∶1，3∶1）依次洗脫得12 個流分（Fr1～Fr12）。Fr2 中結(jié)晶經(jīng)石油醚除雜后得化合物1（100.0 mg）。Fr3 中結(jié)晶經(jīng)二氯甲烷除雜后得化合物2（40.0 mg）。Fr7 經(jīng)Sephadex-LH-20 柱色譜（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）洗脫得到8 個流分（Fr7.1～Fr7.8）。Fr7.7 經(jīng)石油醚重結(jié)晶后得化合物3（4.7 mg）。取乙酸乙酯部位浸膏100.0 g 經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯分別為150∶1，100∶1，50∶1，10∶1，1∶1）梯度洗脫得到10 個流分（Fr1～Fr10）。Fr2 經(jīng)硅膠柱（石油醚）等度洗脫得到4 個流分（Fr2.1～Fr2.4）。Fr2.3 經(jīng)制備液相（甲醇-水為70∶30～100∶0，50 min）梯度洗脫得7 個流分（Fr2.3.1～Fr2.3.7）。取Fr2.3.7經(jīng)硅膠制備薄層（石油醚-乙酸乙酯＝25∶1）得化合物4（2.2 mg）。Fr3 經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯＝120∶1）等度洗脫得到4 個流分（Fr3.1～Fr3.4）。Fr3.3 經(jīng)制備液相（甲醇-水為70∶30～100∶0，50 min）得化合物5（3.1 mg，tR＝35 min）。Fr4 經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯分別為120∶1，60∶1，30∶1）梯度洗脫得到6 個流分（Fr4.1～Fr4.6）。Fr4.4 經(jīng)制備液相（甲醇-水為70∶30～100∶0，50 min）后經(jīng)硅膠制備薄層[石油醚-乙酸乙酯＝8∶1（含0.01%甲酸）]得化合物6（3.5 mg）和化合物7（4.8 mg）。Fr6 經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯30∶1＋0.01%甲酸）梯度洗脫得到6 個流分（Fr6.1～Fr6.6）。Fr6.3 經(jīng)制備液相（甲醇-水為70∶30～100∶0，50 min）得化合物8（2.8 mg，tR＝13.5 min）和化合物9（70.1 mg，tR＝25.5 min）。Fr8 經(jīng)制備液相（甲醇-水為30 ∶70～70∶30 洗脫30 min 后又經(jīng)甲醇-水為70 ∶30～100∶0 洗脫30 min）得到8 個流分（Fr8.1～Fr8.8）。Fr8.3 重結(jié)晶后經(jīng)制備液相（甲醇-水＝40∶60）純化得化合物10（12.8 mg，tR＝18 min）。Fr8.6 經(jīng)制備液相（乙腈-水＝60∶40）得化合物11（16.8 mg，tR＝20 min）。取30%乙醇部位浸膏75.5 g 經(jīng)硅膠柱（二氯甲烷-甲醇分別為10∶1，5∶1，1∶1）依次洗脫得到6 個流分（Fr1～Fr6）。Fr1 經(jīng)硅膠柱（二氯甲烷-甲醇分別為80∶1，20∶1，8∶1）依次洗脫得到5 個流分（Fr1.1～Fr1.5）。Fr1.2 經(jīng)制備液相（甲醇-水＝40∶60）洗脫得化合物12（6.7 mg，tR＝21 min）。Fr1.3 經(jīng)ODS 柱（甲醇-水分別為10∶90，40∶70，100∶0）依次洗脫得到10 個流分（Fr1.3.1～Fr1.3.10）。Fr1.3.1 經(jīng)制備液相（甲醇-水＝55∶45）洗脫得化合物13（5.8 mg，tR＝10 min）。Fr1.3.3 經(jīng)制備液相（甲醇-水＝5∶95）洗脫得化合物14（3.0 mg，tR＝20 min）和化合物15（2.0 mg，tR＝26 min）。

2.2 分子對接

在chemdraw 中畫出所有化合物的結(jié)構(gòu)，在PubChem 中下載苯唑西林（青霉素類抗菌藥物）的結(jié)構(gòu)，將每個結(jié)構(gòu)保存為SDF 格式文件，建立小分子配體數(shù)據(jù)庫。將小分子配體數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入Discovery Studio（DS）v 17.2.0 軟件，使用Prepare Ligands 功能優(yōu)化小分子構(gòu)象。從蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB 中下載PBP2a（編號：3ZFZ）的晶體結(jié)構(gòu)[9]（青霉素結(jié)合蛋白PBP2a 與抗菌藥物的低親和力是其產(chǎn)生廣泛臨床耐藥性的關(guān)鍵因素[10]）。將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到DS 進(jìn)行去水、加氫、加電荷等優(yōu)化后，提取原配體（頭孢洛林酯）作為對接的活性位點(diǎn)。將小分子配體數(shù)據(jù)庫與PBP2a 在DS 中使用CDOCKER 模塊進(jìn)行半柔性對接，以結(jié)合能作為打分函數(shù)評判配體與蛋白的結(jié)合能力，以苯唑西林和頭孢洛林酯為陽性對照。打分值越高的配體代表其與PBP2a 的結(jié)合能力越強(qiáng)，化合物則可能具有抗MRSA 的活性，有一定的開發(fā)潛力。

2.3 體外抗菌活性的測定

2.3.1 菌懸液的制備 取適量金黃色葡萄球菌（bio-00018）接種于BHI 液體培養(yǎng)基，恒溫37 ℃搖床培養(yǎng)24 h。以每0.1OD600相當(dāng)于1×108CFU·mL－1為標(biāo)準(zhǔn)[11]，用新鮮滅菌的BHI 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至吸光度值為0.5，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3.2 抑菌圈的測定 參照文獻(xiàn)的方法[12-13]，采用紙片擴(kuò)散法來測定化合物的抑菌圈直徑。在無菌超凈工作臺中，兩次取500 μL 配好的菌懸液均勻涂抹在滅菌固體培養(yǎng)基中制成含菌平皿。用二甲基亞砜（DMSO）溶解化合物配成質(zhì)量濃度為128.0 μg·mL－1的樣品。取25 μL 樣品置于直徑6 mm 的濾紙片上后等距貼于含菌平皿上。硫酸慶大霉素和DMSO 濾紙片分別作為陽性對照和陰性對照。將平皿于37℃恒溫培養(yǎng)18 h，每份樣品平行操作3 次，測量抑菌圈直徑后結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 無色結(jié)晶。HR-ESI-MS：m/z211.0966 [M＋H]＋（Calcd.211.0970），分子式為C11H14O4。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：11.86（1H，s，2-OH），6.33（1H，d，J＝2.2 Hz，H-5），6.28（1H，d，J＝2.2 Hz，H-3），4.39（2H，q，J＝7.1 Hz，H-8），3.79（3H，s，4-OCH3），2.51（3H，s，6-CH3），1.41（3H，t，J＝7.1 Hz，H-9）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）δ：171.7（C-7），165.6（C-2），163.8（C-3），143.1（C-6），111.1（C-5），105.4（C-1），98.7（C-3），61.2（C-8），55.3（4-OCH3），24.4（6-CH3），14.2（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[6]一致，故鑒定化合物1 為扁枝衣酸乙酯。

化合物2：無色結(jié)晶。HR-ESI-MS：m/z183.0655 [M＋H]＋（Calcd.183.0657），分子式為C9H10O4。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ： 11.54（1H，s，2-OH），6.35（1H，d，J＝2.4 Hz，H-5），6.33（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3），3.82（3H，s，4-OCH3），2.58（3H，s，6-CH3）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：175.7（C-7），166.6（C-4），165.0（C-2），144.7（C-6），111.7（C-5），103.8（C-1），98.8（C-3），55.4（4-OCH3），24.4（6-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致，故鑒定化合物2 為扁枝衣酸。

化合物3： 無色結(jié)晶。HR-ESI-MS：m/z197.0805 [M＋H]＋（Calcd.197.0814），分子式為C10H12O4。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：12.03（1H，s，2-OH），6.21（1H，s，H-5），5.14（1H，s，4-OH），3.92（3H，s，7-OCH3），2.46（3H，s，6-CH3），2.10（3H，s，3-CH3）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）δ：172.6（C-7），163.2（C-4），158.0（C-2），140.1（C-6），110.5（C-5），108.5（C-3），105.2（C-1），51.8（7-OCH3），24.1（6-CH3），7.7（3-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]一致，故鑒定化合物3 為atraric acid。

化合物4： 無色油狀。HR-ESI-MS：m/z293.2475 [M＋H]＋（Calcd.293.2481），分子式為C19H32O2。IR（KBr）：νmax2929，2853，1732，1266，729 cm－1。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.32～5.40（6H，m，H-9，10，12，13，15，16），3.66（3H，s，1-OCH3），2.81（4H，t，J＝5.6 Hz，H-11，14），2.30（2H，t，J＝7.5 Hz，H-2），2.07（4H，m，H-8，17），1.64（2H，m，H-3），1.29～1.37（8H，m，H-4，5，6，7），0.98（3H，t，J＝7.5 Hz，H-18）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）δ：174.3（C-1），132.0（C-16），130.3（C-9），128.3（C-13），128.3（C-12），127.7（C-10），127.1（C-15），51.5（1-OCH3），34.1（C-2），29.7（C-7），29.6（C-6），29.2（C-5），29.1（C-4），27.2（C-8），25.6（C-11），25.2（C-14），25.0（C-3），20.6（C-17），14.3（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]一致。根據(jù)紅外光譜（IR）數(shù)據(jù)，νmax2929，2853 cm－1為亞甲基（C-H）伸縮振動信號，1732 cm－1為羰基（C＝O）伸縮振動信號，1266 cm－1為C-O 伸縮振動信號，729 cm－1為順式烯烴面外C-H 彎曲振動信號（順式：730～665 cm－1；反式：980～960 cm－1）。順式脂肪酸室溫下呈液態(tài)、油狀，而反式脂肪酸室溫下呈固態(tài)[17]。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)以及理化性質(zhì)，鑒定化合物4 為α-亞麻酸甲酯。

化合物5： 無色油狀。HR-ESI-MS：m/z303.1223 [M＋H]＋（Calcd.303.1232），分子式為C17H18O5。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.71（1H，s，H-4'），6.63（1H，s，H-6'），6.61（1H，s，H-2'），6.42（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3），6.39（1H，d，J＝2.4 Hz，H-5），3.84（3H，s，4-OCH3），3.80（3H，s，3'-OCH3），2.62（3H，s，6-CH3），2.36（3H，s，5'-CH3）。13C-NMR（151 MHz，CD3OD）δ：171.3（C-7），166.4（C-2），165.9（C-4），162.0（C-3'），152.3（C-1'），144.3（C-6），141.7（C-5'），115.7（C-6'），113.6（C-4'），112.0（C-5），106.7（C-1），106.0（C-2'），99.9（C-3），55.9（4-OCH3），55.9（3'-OCH3），24.3（6-CH3），21.5（5'-CH3）。氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[18]一致，結(jié)合HSQC 和HMBC 譜經(jīng)SciFinder數(shù)據(jù)庫檢索確定化合物5 為2'-O-methylevernol。

化合物6： 無色油狀。HR-ESI-MS：m/z279.2321 [M＋H]＋（Calcd.279.2324），分子式為C18H30O2。IR（KBr）：νmax2925，2854，1712，1260，722 cm－1。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.32～5.40（6H，m，H-9，10，12，13，15，16），2.81（4H，t，J＝5.6 Hz，H-11，14），2.35（2H，t，J＝7.5 Hz，H-2），2.09（2H，m，H-8），2.05（2H，m，H-17），1.64（2H，m，H-3），1.29～1.37（8H，m，H-4，5，6，7），0.98（3H，t，J＝7.5 Hz，H-18）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）δ：178.8（C-1），132.0（C-16），130.2（C-9），128.3（C-12），128.2（C-13），127.7（C-15），127.1（C-10），33.8（C-2），29.6（C-7），29.1（C-5），29.1（C-6），29.0（C-4），27.2（C-8），25.6（C-11），25.5（C-14），24.7（C-3），20.6（C-17），14.3（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[19]一致。根據(jù)紅外光譜（IR）數(shù)據(jù)，νmax2925，2854 cm－1為亞甲基（C-H）伸縮振動信號，1712 cm－1為羰基（C＝O）伸縮振動信號，1260 cm－1為C-O伸縮振動信號，722 cm－1為順式烯烴面外C-H 彎曲振動信號。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)以及理化性質(zhì)，鑒定化合物6 為α-亞麻酸。

化合物7： 無色油狀。HR-ESI-MS：m/z281.2487 [M＋H]＋（Calcd.281.2481），分子式為C18H32O2。IR（KBr）：νmax2930，2855，1710，1220，725 cm－1。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.32～5.38（4H，m，H-9，10，12，13），2.77（2H，t，J＝6.8 Hz，H-11），2.35（2H，t，J＝7.6 Hz，H-2），2.05（2H，m，H-14），2.04（2H，m，H-8），1.62（2H，m，H-3），1.28～1.37（14H，m，H-4，5，6，7，15，16，17），0.89（3H，t，J＝6.9 Hz，H-18）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）δ：179.3（C-1），130.2（C-13），130.0（C-9），128.1（C-10），127.9（C-12），33.9（C-2），31.5（C-16），29.6（C-7），29.4（C-15），29.2（C-6），29.1（C-5），29.0（C-4），27.2（C-14），27.2（C-8），25.6（C-11），24.7（C-3），22.6（C-17），14.1（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[20]一致。根據(jù)紅外光譜（IR）數(shù)據(jù)，νmax2930，2855 cm－1為亞甲基（C-H）伸縮振動信號，1710 cm－1為羰基（C＝O）伸縮振動信號，1220 cm－1為C-O 伸縮振動信號，725 cm－1為順式烯烴面外C-H 彎曲振動信號。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)以及理化性質(zhì)，鑒定化合物7 為亞油酸。

化合物8：白色粉末。HR-ESI-MS：m/z153.0433 [M＋H]＋（Calcd.153.0552），分子式為C8H8O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：10.07（1H，s，H-7），6.22（1H，d，J＝2.2 Hz，H-5），6.11（1H，d，J＝2.2 Hz，H-3），2.51（3H，s，6-CH3）。13C-NMR（151 MHz，CD3OD）δ：194.3（C-7），167.5（C-4），167.2（C-2），146.3（C-6），114.1（C-1），111.8（C-5），101.5（C-3），18.3（6-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[21]一致，故鑒定化合物8 為苔色醛。

化合物9： 無色結(jié)晶。HR-ESI-MS：m/z289.1070 [M＋H]＋（Calcd.289.1076），分子式為C16H16O5。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：11.48（1H，s，2-OH），6.59（1H，s，H-6'），6.58（1H，s，H-4'），6.50（1H，s，H-2'），6.38（1H，d，J＝2.5 Hz，H-3），6.36（1H，d，J＝2.5 Hz，H-5），3.83（3H，s，4-OCH3），2.63（3H，s，6-CH3），2.33（3H，s，5'-CH3）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）δ：170.4（C-7），166.3（C-2），164.6（C-4），156.3（C-3'），150.6（C-1'），143.5（C-6），141.0（C-5'），114.8（C-6'），114.2（C-4'），111.8（C-5），106.5（C-1），104.5（C-2'），98.9（C-3），55.4（4-OCH3），24.6（6-CH3），21.4（5'-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[6]一致，故鑒定化合物9 為3-羥基-5-甲基苯基-2-羥基-4-甲氧基-6-甲基苯甲酸酯。

化合物10：無色結(jié)晶。HR-ESI-MS：m/z169.0495 [M＋H]＋（Calcd.169.0501），分子式為C8H8O4。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ： 6.19（1H，d，J＝2.4 Hz，H-5），6.14（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3），2.48（3H，s，6-CH3）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：175.1（C-7），167.0（C-4），163.7（C-2），145.3（C-6），112.3（C-5），105.4（C-1），101.6（C-3），24.3（6-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[22]一致，故鑒定化合物10 為苔色酸。

化合物11： 無色結(jié)晶。HR-ESI-MS：m/z275.0906 [M＋H]＋（Calcd.275.0910），分子式為C15H14O5。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.55（1H，s，H-6'），6.49（1H，s，H-4'），6.43（1H，s，H-2'），6.28（1H，d，J＝2.4 Hz，H-5），6.21（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3），2.56（3H，s，6-CH3），2.29（3H，s，5'-CH3）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：174.3（C-7），166.6（C-4），164.4（C-2），159.4（C-3'），152.2（C-1'），144.7（C-6），141.8（C-5'），114.8（C-6'），114.5（C-4'），112.8（C-5），107.3（C-2'），105.4（C-1），101.8（C-3），24.3（6-CH3），21.4（5'-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[23]一致，故鑒定化合物11 為瘤網(wǎng)地衣素。

化合物12：白色粉末。HR-ESI-MS：m/z125.0595 [M＋H]＋（Calcd.125.0603），分子式為C7H8O2。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.12（1H，d，J＝2.1 Hz，H-4），6.12（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），6.07（1H，t，J＝2.1 Hz，H-2），2.17（3H，s，5-CH3）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：157.8（C-1，3），139.7（C-5），107.1（C-4，6），99.2（C-2），20.1（5-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[24]一致，故鑒定化合物12 為苔黑酚。

化合物13：黃色油狀。HR-ESI-MS：m/z127.0388 [M＋H]＋（Calcd.127.0395），分子式為C6H6O3。1H-NMR（500 MHz，CD3OD），9.53（1H，s，H-6），δ：7.38（1H，d，J＝3.6 Hz，H-3），6.58（1H，d，J＝3.6 Hz，H-4），4.61（2H，s，H-7）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：179.4（C-6），163.2（C-2），153.9（C-5），124.8（C-3），110.9（C-4），57.5（C-7）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[25]一致，故鑒定化合物13 為5-羥甲基糠醛。

化合物14：無色油狀。HR-ESI-MS：m/z167.0787 [M＋Na]＋（Calcd.167.0796），分子式為C6H12N2O2。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：3.12（2H，t，J＝7.0 Hz，H-4），2.15（2H，t，J＝7.5 Hz，H-2），1.86（3H，s，H-6），1.71（2H，m，H-3）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：178.4（C-1），173.4（C-5），39.9（C-4），33.7（C-2），26.6（C-4），22.5（C-6）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[26]一致，故鑒定化合物14 為4-（乙酰氨基）丁酰胺。

化合物15：無色油狀。HR-ESI-MS：m/z245.0759 [M＋H]＋（Calcd.245.0774），分子式為C9H12N2O6。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：8.03（1H，d，J＝8.1 Hz，H-6），5.90（1H，d，J＝4.6 Hz，H-1'），5.70（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5），4.17（1H，m，H-2'），4.14（1H，m，H-3'），4.00（1H，m，H-4'），3.84（1H，dd，J＝12.2，2.0 Hz，H-5'a），3.73（1H，dd，J＝12.2，2.6 Hz，H-5'b）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：164.8（C-4），151.1（C-2），141.3（C-6），101.2（C-5），89.2（C-1'），84.9（C-4'），74.3（C-3'），69.9（C-2'），60.8（C-5'）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[27]一致，故鑒定化合物15 為尿嘧啶核苷。

3.2 分子對接結(jié)果

基于分子對接虛擬篩選環(huán)裂松蘿中與PBP2a結(jié)合能力較強(qiáng)的化學(xué)成分，對接結(jié)果如表1。打分值高于苯唑西林的有候選化合物6、7、11，其中化合物11 的打分值最高?；衔?1 與PBP2a對接的相互作用力分析如圖2。

表1 配體與PBP2a 的對接結(jié)果Tab 1 Docking results of the ligands with PBP2a

PBP2a 與頭孢洛林酯（原配體）結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基LYS273、ASN146、TYR105 形成常規(guī)氫鍵。由圖2可知，在配體與蛋白的相互作用中，化合物11 可與PBP2a 的氨基酸殘基ARG298形成鹽橋，與TYR105、SER306、ASN307 之間形成常規(guī)氫鍵、與ASN146 之間形成π-供體氫鍵、與ILE309 之間形成π-烷基作用。

圖2 化合物11 與PBP2a 的相互作用分析圖Fig 2 Analysis plot of the interaction between compound 11 and PBP2a

3.3 抗菌活性測定結(jié)果

采用紙片擴(kuò)散法對化合物1～15 進(jìn)行活性測試。結(jié)果表明化合物5、8、9 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為6.4、6.6、6.6 mm，小于陽性對照藥（硫酸慶大霉素）的12.3 mm。其余化合物未表現(xiàn)出明顯的抑菌圈。

4 討論

環(huán)裂松蘿作為傳統(tǒng)地衣類中藥，具有廣譜抗菌活性，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍然需要進(jìn)一步明確。本研究從環(huán)裂松蘿的乙醇提取物中分離得到15個化合物，包括多取代單苯環(huán)類1～3、8、10、12，縮酚酸類5、9、11，脂肪酸類4、6、7，糠醛類13，氨基酸類14，核苷類15。化合物4、5、8、13～15 為首次從松蘿屬中發(fā)現(xiàn)。

采用分子對接虛擬篩選與PBP2a 親和力較高的配體?；衔?、7 和11 與PBP2a 的結(jié)合能力強(qiáng)于陽性藥苯唑西林，證明其可能具有抗MRSA 的活性，有一定的開發(fā)潛力?；衔?、7 廣泛存在于自然界，可與PBP2a 特異性結(jié)合以及與MRSA 體內(nèi)的烯酰-ACP 還原酶（FabI）、FabI-NADPH 復(fù)合物結(jié)合以改變細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮抗菌作用，其順式構(gòu)型以及長鏈結(jié)構(gòu)能增加抗MRSA 的活性[28-32]?；衔?1 與PBP2a 的結(jié)合能力最強(qiáng)，而相關(guān)的抑制MRSA 活性研究尚未報(bào)道，本課題組正在對其進(jìn)行研究。化合物5、8、9 對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。3 個縮酚酸類化合物，2 個脂肪酸類化合物，1 個單苯環(huán)類化合物可能對金黃色葡萄球菌或變異后的耐藥菌有抑制活性。根據(jù)分子對接結(jié)果，預(yù)測羥基是其發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵活性基團(tuán)。上述化合物結(jié)構(gòu)中不含內(nèi)酰胺基團(tuán)，單獨(dú)或與抗菌藥物協(xié)同使用以及探索構(gòu)效關(guān)系可作為進(jìn)一步研究方向。