朱江麗，許 諾，鄭衛(wèi)國(guó)，宮彥章，高育慧，蔡金術(shù)

（深圳文科園林股份有限公司，廣東省園林景觀與生態(tài)恢復(fù)工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518026）

金花茶（Camellia nitidssima）是山茶科山茶屬的灌木或小喬木，花色金黃艷麗，觀賞價(jià)值極高。山茶科植物的花色有紅、白、復(fù)色等多種顏色，但過(guò)去一直缺少黃花顏色。因此，金花茶的發(fā)現(xiàn)引起了國(guó)內(nèi)外植物學(xué)界和園藝學(xué)界的關(guān)注，尤其引起國(guó)際山茶學(xué)會(huì)的高度重視[1]。而且，金花茶具有較高藥用價(jià)值，是一種珍稀種質(zhì)資源，不僅被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，而且被稱作“植物中的大熊貓”和“夢(mèng)幻的金黃山茶”[2]。金花茶主要分布于我國(guó)廣西西南部的防城、龍州、寧明、大新及越南諒山等地。目前，關(guān)于金花茶的研究主要集中在引種栽培[3-4]與繁殖[5-6]、水肥管理[7-8]與病蟲害防治[9-10]、光照環(huán)境適應(yīng)性[11-12]和功能基因研究[13-14]等方面，而關(guān)于金花茶耐寒性及生理特性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。李吉濤等[15-16]比較了8 種金花茶的耐寒性及部分生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其耐寒性依次為金花茶＞龍州金花茶＞毛籽金花茶＞檸檬黃金花茶＞凹脈金花茶＞直脈金花茶＞東興金花茶＞平果金花茶；張武君等[17]研究發(fā)現(xiàn)，廣西防城普通金花茶苗的引種地極端低溫不宜低于-6℃，否則應(yīng)采取防寒保護(hù)措施。筆者以廣西防城金花茶為材料，在0℃低溫環(huán)境下進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的處理，探究廣西防城金花茶抗寒脅迫生理相關(guān)機(jī)制，旨在為金花茶的引種栽培及抗寒育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以福建龍巖基地提供的普通廣西防城金花茶1.5～2.0 a 齡幼苗為試材。

1.2 試驗(yàn)方法

選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致，株高為45～50 cm 的營(yíng)養(yǎng)袋苗置于遮陰大棚中恢復(fù)生長(zhǎng)1 個(gè)月，期間進(jìn)行常規(guī)水分管理。低溫處理在恒溫氣候箱中進(jìn)行，溫度設(shè)為0℃，處理時(shí)間為3、6、9、12、15、18 d，以自然溫度處理為對(duì)照，每個(gè)處理6 株植物，處理完畢后選取植物頂部4～5 片葉進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

細(xì)胞傷害率（CIR）測(cè)定：將經(jīng)過(guò)不同時(shí)間低溫處理的葉片剪成邊長(zhǎng)1 cm 的小塊，用電子天平稱取0.1 g，先用自來(lái)水沖洗干凈，然后用蒸餾水沖洗2 遍，晾干后放入裝有10 mL 蒸餾水的試管中，蓋上試管塞浸泡15 h 后用雷磁DDS-11C 型電導(dǎo)率儀測(cè)定初電導(dǎo)率值R0，然后在沸水浴中煮沸30 min，冷卻至室溫后測(cè)定終電導(dǎo)率值R1，以不經(jīng)低溫處理的植物葉片的電導(dǎo)率為對(duì)照（RCK），各處理細(xì)胞傷害率計(jì)算公式為：CIR（%）=（R0-RCK）/（R1-RCK）×100。

丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、蛋白質(zhì)（SP）含量及SOD、POD 活性采用南京建成生物研究所提供的試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件和SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，利用鄧肯法檢驗(yàn)不同處理之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)金花茶植株形態(tài)的影響

由表1 可知，不同時(shí)長(zhǎng)低溫脅迫后，金花茶植株的形態(tài)發(fā)生了變化；低溫處理3 d 時(shí)，植株葉片有冰凍現(xiàn)象，但顏色正常；低溫處理6～9 d 時(shí)，植株從基部向上2/3 的葉片明顯失水、卷曲，基部葉片沒(méi)有明顯變化；低溫處理12～18 d 時(shí)，整株葉片失水明顯，葉片干枯卷曲。低溫處理后將植株放置于大棚中恢復(fù)生長(zhǎng)3 周后觀察，低溫處理3 d 的植株可恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)；低溫處理6～9 d 的植株不可恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，且植株基部葉片也出現(xiàn)卷曲失水癥狀，樹葉部分掉落，有的甚至整株死亡；低溫處理12～18 d 的植株不可恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，植株整株死亡。

表1 低溫脅迫下金花茶形態(tài)變化

2.2 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片CIR 的影響

從圖1 可以看出，不同時(shí)長(zhǎng)低溫脅迫后，金花茶葉片CIR 先由3 d 的4.07%急劇上升到6 d 的71.64%，然后從6 d 開始到18 d 保持在68.03%～72.10%。除對(duì)照外，低溫處理3 d 時(shí)CIR 最小，為4.07%，低溫處理15 d 時(shí)CIR 最高，為72.10%。方差分析結(jié)果顯示，除低溫處理3 d 與對(duì)照差異不顯著（P＜0.05）外，低溫處理6～18 d 后植株的CIR 值均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），表明低溫處理時(shí)間超過(guò)6 d 時(shí)，金花茶葉片細(xì)胞膜受到了嚴(yán)重傷害。

圖1 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片CIR 的影響

2.3 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片MDA 含量的影響

低溫使植物產(chǎn)生過(guò)氧化產(chǎn)物，MDA 是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)。由圖2 可知，低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)能促進(jìn)金花茶葉片MDA 含量的積累，處理時(shí)間越長(zhǎng)，MDA積累的越多；對(duì)照處理植株的MDA 含量最低，為13.84 nmol/g；低溫處理18 d 時(shí)植株的MDA 含量最高，為41.07 nmol/g，是對(duì)照的2.97 倍。方差分析結(jié)果顯示，除低溫處理3 d 與對(duì)照無(wú)顯著差異外，其他各處理均與對(duì)照差異顯著（P＜0.05），表明隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，金花茶葉片細(xì)胞受傷害程度也越大。

圖2 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片MDA 含量的影響

2.4 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片保護(hù)酶活性的影響

由圖3 可知，金花茶葉片SOD 活性隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后降低，在處理0～15 d 時(shí)，SOD活性一直呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；在15～18 d 時(shí)，SOD 活性呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；對(duì)照處理植株葉片的SOD 活性最低，為1 759.56 U/g；低溫處理15 d 時(shí)植株葉片的SOD 活性最高，為2 506.26 U/g，較對(duì)照增加了42.44%。方差分析結(jié)果顯示，低溫處理3 d 植株葉片的SOD 活性與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05），而低溫處理6～18 d 時(shí)，植株葉片的SOD 活性顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。

圖3 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片SOD 活性的影響

由圖4 可知，金花茶葉片POD 活性隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)，處理0～15 d 時(shí)，POD 活性呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)，處理15～18 d 時(shí)呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)；對(duì)照處理植株葉片的POD 活性最高，為382.41 U/g；低溫處理15 d 時(shí)植株葉片的POD 活性最低，為161.11 U/g，較對(duì)照下降了57.87%。方差分析結(jié)果顯示，低溫處理與對(duì)照間差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

圖4 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片POD 活性的影響

2.5 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖5 可知，低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)能增加金花茶葉片SS 含量，且在0～12 d 時(shí)，SS 含量增加速度較快，在12～18 d 時(shí)，SS 含量增加速度減緩；對(duì)照處理植株葉片的SS 含量最低，為59.19 mg/g；低溫處理18 d時(shí)植株葉片的SS 含量最高，為162.8 mg/g，是對(duì)照的2.75 倍。方差分析結(jié)果顯示，低溫處理與對(duì)照間差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

圖5 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片SS 含量的影響

由圖6 可知，金花茶葉片SP 含量隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，且上升速度緩慢；對(duì)照SP 含量最低，為0.21 mg/mL，低溫處理18 d 時(shí)SP 含量最高，為0.36 mg/mL，是對(duì)照的1.71 倍。除低溫處理3 d 與對(duì)照差異不顯著外，其他處理與對(duì)照差異均顯著（P＜0.05）。

圖6 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片SP 含量的影響

3 討論與結(jié)論

植物受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)代謝平衡被破壞，自由基大量積累，破壞了膜系統(tǒng)，從而引起電解質(zhì)外滲、細(xì)胞傷害率增大等生理代謝[18-21]。MDA 含量是植物抗逆生理研究的一個(gè)常用指標(biāo)，可以反映植物膜系統(tǒng)的受傷程度[22]。MDA 含量的增加表明植物細(xì)胞膜透性的增加。該研究中，金花茶葉片細(xì)胞傷害率和MDA 含量在低溫處理3 d 時(shí)與對(duì)照的差異均不顯著，說(shuō)明3 d 的低溫處理未對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損害；而低溫處理6～18 d 時(shí)，金花茶葉片細(xì)胞的傷害率和MDA含量均與對(duì)照產(chǎn)生顯著的差異，說(shuō)明低溫處理6～18 d已對(duì)金花茶葉片細(xì)胞膜造成嚴(yán)重的損傷。

SOD 和POD 是植物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分，它們有一定的自我調(diào)節(jié)功能，可以清除因低溫脅迫而產(chǎn)生的過(guò)多活性氧，這是機(jī)體適應(yīng)低溫環(huán)境的一種應(yīng)激保護(hù)機(jī)制。有的植物SOD 和POD 的調(diào)節(jié)能力強(qiáng)，因而可以很好地保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)植株的抗逆能力，提高植株的抗逆性[23]。該研究中金花茶葉片SOD 活性在低溫處理0～15 d 時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在低溫處理15～18 d 時(shí)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表明在可耐受的低溫處理時(shí)間內(nèi)，金花茶葉片可通過(guò)提高SOD 活性來(lái)增強(qiáng)抗寒能力，維持細(xì)胞的正常生理功能，但當(dāng)?shù)蜏靥幚頃r(shí)間達(dá)到極限時(shí)，細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)會(huì)遭受破壞，進(jìn)而導(dǎo)致SOD 活性降低。而葉片中POD 活性隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先下降后上升趨勢(shì)，且各處理與對(duì)照間差異均顯著，表明POD 活性對(duì)低溫時(shí)間的延長(zhǎng)非常敏感，低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)使葉片中POD 活性受到抑制。

SS 是植物光合作用和呼吸作用等重要生命活動(dòng)的能源物質(zhì)，可增加細(xì)胞的保水能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，降低細(xì)胞質(zhì)冰點(diǎn)，提高植物抗寒能力，是細(xì)胞內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[24]。該研究中，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SS 含量升高，且各處理與對(duì)照差異顯著，但是低溫處理12、15、18 d 這3 個(gè)處理間無(wú)顯著差異，說(shuō)明金花茶葉片受到低溫脅迫時(shí)，低溫時(shí)間越長(zhǎng)SS 含量越高，但低溫時(shí)間延長(zhǎng)到一定程度時(shí)，SS 含量變化不明顯。

SP 有助于增強(qiáng)細(xì)胞持水力，保護(hù)原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞液濃度和滲透勢(shì)，也是細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)。該研究中，SP 含量隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且低溫處理3 d 時(shí)SP 含量與對(duì)照差異不顯著，低溫處理6～18 d 時(shí)SP 含量與對(duì)照差異顯著，說(shuō)明金花茶葉片可通過(guò)增加SP 含量來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，低溫處理時(shí)間超過(guò)6 d 時(shí)，SP 含量顯著增加以抵抗低溫逆境，這與楊鴻基等[25]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，金花茶植株在0℃低溫脅迫時(shí)間不超過(guò)3 d 時(shí)，受凍不明顯，室溫下能恢復(fù)生長(zhǎng)，且生理指標(biāo)變化與對(duì)照相比大多不顯著；低溫脅迫時(shí)間為6～9 d 時(shí)，植株受凍明顯，基部以上2/3 葉片失水卷曲，且部分植株不可恢復(fù)生長(zhǎng)而死亡；低溫脅迫時(shí)間為12～18 d 時(shí)，植株受凍嚴(yán)重，葉片基本全部失水卷曲，且植株不可恢復(fù)生長(zhǎng)而全部死亡，同時(shí)葉片生理指標(biāo)也發(fā)生顯著變化。因此，金花茶在0℃下最長(zhǎng)耐受時(shí)間為3 d。該試驗(yàn)低溫處理時(shí)間設(shè)置以3 d 為一階段，實(shí)際生產(chǎn)中低溫脅迫時(shí)間可能為1～2 d 或4～5 d，其耐寒形態(tài)和生理指標(biāo)變化有待進(jìn)一步深入研究。