王玉波，鄧煒杰，陳薪竹，王 丹，洪艷平，熊建華，戴 棚，楊武英

(1.南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045；2.四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川成都 610041)

傳統(tǒng)多克隆抗體和單克隆抗體的制備需從抗原、包被原的合成開始，其間會用到大量的化學(xué)試劑，對操作者的健康產(chǎn)生危害，而且還需要對動物進行免疫，細胞融合耗費較多的時間。基因工程方法把抗體的制備提高到新的高度，擺脫了傳統(tǒng)抗體制備的繁瑣和復(fù)雜，不需要通過細胞雜交，直接在分子水平進行研究，完善傳統(tǒng)抗體制備的方法，彌補其不足，提高并擴大了抗體的應(yīng)用范圍[19-22]。單鏈抗體(scFv)是近年來流行的一種新型基因工程抗體，僅含抗體重鏈 (VH)和輕鏈(VL)，由一條單一肽鏈連接而成。scFv具有體積小、特異性和親和力高、免疫原性低、基因工程能力強等優(yōu)點，且抗體生產(chǎn)周期短、成本低，可在細菌表達系統(tǒng)中進行快速大規(guī)模制備。因此，scFv近年在各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其是在農(nóng)獸藥殘留免疫檢測方面[23-26]。scFv可以與堿性磷酸酶(AP)偶聯(lián)形成融合蛋白，該蛋白具備scFv分子生物活性和AP酶活性，酶標(biāo)二抗在檢測實際樣品時被刪減，有利于縮短試驗時間、節(jié)省成本，減少生物試劑對操作者健康的危害。

本研究室在前期工作中已經(jīng)成功構(gòu)建得到抗AOZ衍生物單鏈抗體(AOZscFv)基因，并把AOZscFv基因轉(zhuǎn)入到可溶性表達載體plip6/GN 中和堿性磷酸酶基因進行融合表達，但是發(fā)現(xiàn)表達量偏低[27]。本試驗首先測定抗AOZ衍生物scFv基因工程宿主菌生長曲線，然后經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blotting)分析鑒定后，通過探討5種培養(yǎng)基、6種誘導(dǎo)時間、4種IPTG(誘導(dǎo)劑-異丙基硫代半乳糖苷)濃度對融合蛋白表達的影響，來提高大腸桿菌中融合蛋白的表達量，然后利用NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱對該融合蛋白進行親和層析純化，采用直接競爭酶聯(lián)免疫分析法(dcELISA)檢測該融合蛋白的生物活性，為后期抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白大量生產(chǎn)和呋喃唑酮代謝物AOZ在動物性食品中殘留免疫快檢的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗時間為2021年3月，試驗地點為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室。

試驗菌種：BL21(DE3)[BL21(DE3)是含有噬菌體T7 RNA 聚合酶溶原的BL21菌株，適用于含有依賴T7 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動子的載體]購自北京全式金生物有限公司，抗AOZ衍生物scFv陽性基因工程宿主菌plip6/GN-scFv/BL21由本實驗室制備保存。

試劑：SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、凝膠蛋白質(zhì)染色液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；蛋白Marker、2xSDS上樣緩沖液、誘導(dǎo)表達劑IPTG、PEG10000、5000DNA Marker(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白胨、酵母提取物均(英國OXOID公司)、NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱(GE公司)；底物溶液對硝基苯磷酸二鈉 (北京百靈威科技有限公司)。

主要儀器設(shè)備：智能生化培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)振蕩器、智能超凈工作臺(江蘇迅迪儀器科技有限公司)；蛋白電泳儀、酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)、超微量核酸分析儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗AOZ衍生物scFv基因工程宿主菌生長曲線的測定 將本研究室構(gòu)建并冷凍保存的抗AOZ衍生物scFv陽性基因工程宿主菌plip6/GN-scFv/BL21復(fù)蘇培養(yǎng)，按5%的接種量轉(zhuǎn)接至15 mL 剛剛配置好的含氨芐青霉素(Amp，100μg/mL)的LB 培養(yǎng)基(Luria-Bertani)中，每隔2 h測其D600 nm值，檢測至18 h即可，每次做3個平行試驗，計算數(shù)據(jù)并繪制生長曲線。

1.2.2 單鏈抗體的表達鑒定 復(fù)蘇培養(yǎng)的菌液，在50 mL LB-Amp培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接10%接種量，將培養(yǎng)基置于37 ℃下培養(yǎng)，直至600 nm波長處吸光度保持在0.6～0.8的范圍內(nèi)，加入誘導(dǎo)劑(IPTG) 50 μL，使培養(yǎng)基最終濃度為0.6 mmol/L；再將培養(yǎng)基置于轉(zhuǎn)速為180 r/min、溫度為28 ℃的搖床上，培養(yǎng)7 h后，采用超聲對AOZscFv-AP融合蛋白進行提取[28]，最后，利用 SDS-PAGE和Western-blotting分析鑒定，同時設(shè)空載體為空白對照。

1.2.3 最適培養(yǎng)基的選擇 復(fù)蘇培養(yǎng)的菌液分別采用2×YT 培養(yǎng)基(2× YT medium)、TB 培養(yǎng)基(terrific broth)、SB 培養(yǎng)基(super broth)、LB 培養(yǎng)基、SOB 培養(yǎng)基(super optimal broth)5種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后分別加入誘導(dǎo)劑IPTG，以28 ℃、280 r/min 搖床培養(yǎng)7 h后，收集菌體，對表達的目的蛋白進行超聲提取，再通過SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳查看不同培養(yǎng)基下抗體蛋白的表達情況。

1.2.4 誘導(dǎo)表達時間的選擇 復(fù)蘇培養(yǎng)的菌液，接種至上述優(yōu)選出的最適培養(yǎng)基后進行搖床培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑IPTG，再用28 ℃、280 r/min分別誘導(dǎo)5、6、7、8、9、10 h，收集菌體，對表達的目的蛋白進行超聲提取，再利用SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳分析6種誘導(dǎo)時間下抗體蛋白的表達情況。

1.2.5 IPTG濃度的選擇 在上述優(yōu)選出的最適培養(yǎng)基和最佳誘導(dǎo)表達時間下，在菌液中分別加入不同質(zhì)量的誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度分別為0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L，用28 ℃、280 r/min誘導(dǎo)表達，收集菌體，對表達的目的蛋白進行超聲提取，通過 SDS-PAGE 蛋白質(zhì)凝膠電泳查看不同IPTG濃度下抗體蛋白的表達情況。

1.2.6 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白的純化 用磷酸鹽緩沖液(PBS)將包被抗原AOZ-COOH-OVA稀釋至1 mg/mL，4 ℃冰箱備用。取 NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱填料1 mL加入到層析柱中，用0.1 mol/L HCl洗滌填料，然后加入稀釋好的抗原溶液，置于4 ℃冰箱過夜。次日收集抗原溶液，用 2 mL 封閉緩沖液封閉2 h，棄掉封閉緩沖液后，用緩沖液A和緩沖液B反復(fù)交替洗滌填料至少6次，隨后將填料儲存于PBS緩沖液中，備用。將處理好的純化柱取出，棄掉PBS后，加入濃縮的抗AOZ衍生物scFv融合蛋白超聲波破碎提取液進行親和吸附，用PBS反復(fù)平衡柱子，加入甘氨酸鹽酸(Gly-HCl)洗脫scFv蛋白，并立即用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)中和蛋白，使用聚乙二醇10000(PEG10000)濃縮，通過SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳查看結(jié)果，并用超微量核酸分析儀測定純化后融合蛋白的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗AOZ衍生物scFv基因工程宿主菌生長曲線的測定

將基因工程菌plip6/GN-scFv/BL21(DE3) 和對照菌株BL21(DE3) 復(fù)蘇、擴大培養(yǎng)后，每2 h于600 nm波長處測定其吸光度，以D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線，結(jié)果見圖1，培養(yǎng)0～16 h時，基因工程菌與對照菌的生長趨勢隨時間的延長而上升；16 h后，生長緩慢，且二者的生長趨勢基本一致。說明該外源基因沒有對宿主菌BL21(DE3) 的生長代謝帶來干擾和負擔(dān)，因此，宿主菌BL21(DE3)適合表達該外源基因。

2.2 單鏈抗體的表達鑒定

基因工程菌培養(yǎng)液加入IPTG后，采用超聲破碎法對誘導(dǎo)表達得到的AOZscFv-AP融合蛋白進行提取，并利用SDS-PAGE(A)和Western-blotting(B)對融合蛋白進行鑒定，結(jié)果見圖2。AOZ單鏈抗體蛋白和AP酶分子量范圍分別為20～30、50～60 ku，綜合2個分子量的范圍可以判斷出融合蛋白分子量在70 ku左右。在SDS-PAGE鑒定圖的泳道2處出現(xiàn)一條新生蛋白帶，約為55～72 ku，確定該條帶就是AOZscFv-AP融合蛋白，Western-blotting鑒定圖也在55～72 ku出現(xiàn)很明顯條帶，再次確定該條帶為AOZscFv-AP融合蛋白。

2.3 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在不同培養(yǎng)基中表達量的變化

在其他條件最適宜的情況下，菌體的生長和蛋白的表達均隨培養(yǎng)基發(fā)生改變受到一定程度的影響[29]，通常情況下，營養(yǎng)成分較高的培養(yǎng)基使細菌的生長更加快速。根據(jù)融合蛋白培養(yǎng)基對營養(yǎng)的需要，培養(yǎng)基必須既能提供微生物生長繁殖的外部生存環(huán)境，又能滿足細胞對營養(yǎng)和能量基礎(chǔ)物質(zhì)的需求，因此，研究抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在5種培養(yǎng)基中表達量的變化，結(jié)果見圖3，經(jīng)2×YT、TB、SB、LB、SOB培養(yǎng)的基因工程菌plip6/GN-scFv/BL21(DE3) 誘導(dǎo)和用Quantity one 4.6.6分析可知，5種培養(yǎng)基表達的蛋白量分別為3.06%、3.40%、4.33%、3.06%、3.77%，其中SB培養(yǎng)基表達的蛋白量最高，說明SB培養(yǎng)基更適合表達抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白。

2.4 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在不同誘導(dǎo)時間下表達量的變化

劉佳璐等研究表明，IPTG誘導(dǎo)劑可使蛋白質(zhì)得到持續(xù)表達，且蛋白表達量直接受到IPTG誘導(dǎo)時間的影響，誘導(dǎo)時間不足會導(dǎo)致蛋白表達量偏少，表達時間過長則會產(chǎn)生不必要的經(jīng)濟損失[30]。為了研究融合蛋白的表達量在不同誘導(dǎo)時間段下的變化，試驗設(shè)置6個誘導(dǎo)時間分析其表達量的不同。由圖4可知，隨著誘導(dǎo)時間的增加，蛋白表達量不斷上升，在9 h左右出現(xiàn)最高值，達到5.71%，在10 h其表達量出現(xiàn)下降趨勢。因此，抗AOZ衍生物 scFv-AP 融合蛋白表達的最佳誘導(dǎo)時間采用9 h。

2.5 抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在不同濃度誘導(dǎo)劑下表達量的變化

由于IPTG具有一定的毒性，當(dāng)其自身濃度過高時，會具有高毒性，破壞菌體的生長，同時也不利于操作者的健康與節(jié)約成本[31]。本試驗設(shè)置4個誘導(dǎo)劑濃度進行試驗。結(jié)果見圖5，當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.6 mmol/L時，蛋白質(zhì)的提取表達效果優(yōu)于其他4個濃度，軟件Quantity one 4.6.6分析其蛋白表達量高達5.82%。因此，0.6 mmol/L的IPTG最適合誘導(dǎo)表達。

綜上所述，最適宜的條件為SB培養(yǎng)基，0.6 mmol/L IPTG，培養(yǎng)9 h。經(jīng)軟件Quantity one V4.6.6分析得到該條帶的表達水平達5.75%，比表達條件優(yōu)化前的表達量(2.89%)增加了約2.86百分點，有效提高了表達量[27]。

2.6 融合蛋白的純化

將樣品過純化柱后，用0.1 mol/L HCl進行洗脫，洗脫液通過PEG10000濃縮，再用SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖6所示，經(jīng)過NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱純化再濃縮后得到的抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白條帶單一、純度高，其融合蛋白的濃度為 1.973 mg/mL，表明該融合蛋白純化效果良好。

2.7 融合蛋白的活性鑒定

采用dcELISA的分析方法檢測“2.6”節(jié)中融合蛋白的活性，以NPAOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度的對數(shù)為x軸，D/D0為y軸(在405 nm波長下，D表示標(biāo)準(zhǔn)藥物濃度梯度的吸光度，D0表示空白的吸光度)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)。通過擬合計算得到50%抑制率(IC50)值為56.923 1 ng/mL。這說明在本試驗選取的表達條件下進行誘導(dǎo)表達得到的抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白具有較好的生物活性。

3 結(jié)論

抗呋喃唑酮代謝物衍生物scFv的基因工程菌plip6/GN-scFv/BL21(DE3) 和對照菌株BL21(DE3)生長曲線結(jié)果表明，外源scFv基因適合通過宿主菌BL21(DE3) 進行表達。前期工作中發(fā)現(xiàn)抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在大腸桿菌中的表達量偏低，僅為胞內(nèi)可溶性表達，目的蛋白只存在于細胞周質(zhì)腔空間中，培養(yǎng)基上清中未發(fā)現(xiàn)目的蛋白，須要采用超聲波破碎法才能從周質(zhì)腔空間中釋放提取出目的蛋白，因此本研究提取目的蛋白時采用超聲波破碎法，有效優(yōu)化了表達條件。通過對誘導(dǎo)表達并超聲波破碎法提取得到的抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白進行SDS-PAGE和Western-blotting鑒定可知，新生蛋白帶出現(xiàn)在55～72 ku之內(nèi)，確定該條帶就是抗AOZscFv-AP融合蛋白。本試驗抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白在5種培養(yǎng)基、6種誘導(dǎo)時間和4種IPTG濃度的條件下，對融合蛋白在大腸桿菌中胞內(nèi)可溶性表達進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最適宜的條件為SB培養(yǎng)基，0.6 mmol/L IPTG，培養(yǎng)9 h，該條件下抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白的表達效果較好，表達量從2.89%增加到5.75%，總體增加了約2.86百分點。本試驗采用NHS活化羧基瓊脂糖凝膠柱對提取得到的蛋白進行親和層析純化，純化后濃縮的融合蛋白的濃度為 1.973 mg/mL，同時dcELISA的 IC50值為 56.923 1 ng/mL，表明在最佳表達條件下得到的融合蛋白經(jīng)純化后具有較好的生物活性，為后期抗AOZ衍生物scFv-AP融合蛋白大量生產(chǎn)制備和呋喃唑酮代謝物AOZ在動物性食品中殘留免疫快檢的建立奠定基礎(chǔ)。