張 涵，徐迪雅，唐東芹，李寶昌

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699；2.上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院，上海 200240)

小蒼蘭(Freesiahybrida)株態(tài)秀麗、花色繁多、花香濃郁，是世界著名的球根花卉，在生產(chǎn)中因小蒼蘭普遍株高葉細(xì)，直立性差，容易出現(xiàn)倒伏和披散現(xiàn)象，一定程度上限制了小蒼蘭的市場(chǎng)開拓[1]。為了改善小蒼蘭的生長(zhǎng)狀態(tài)，增加其觀賞價(jià)值，在盆栽生產(chǎn)時(shí)應(yīng)對(duì)小蒼蘭進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌幚?，在達(dá)到花卉矮化要求的同時(shí)也能最大限度地提高花卉的觀賞價(jià)值[2-3]。近年來已有部分學(xué)者開展過盆栽小蒼蘭的矮化研究，研究較深入的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有多效唑(PP333)[4-5]、比久(B9)[6]、水楊酸(SA)[7-8]、Topflor[9]等，但部分植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在施用濃度、方式與處理時(shí)間的把握方面并沒有達(dá)到理想的效果，部分調(diào)節(jié)劑還會(huì)導(dǎo)致藥害和環(huán)境污染。

調(diào)環(huán)酸鈣作為一種新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能夠有效調(diào)節(jié)植株的新陳代謝，與目前市場(chǎng)常用的三唑類延緩劑相比，殘效期短，殘留量低，對(duì)環(huán)境污染更小，農(nóng)作物更易吸收，更加安全、高效、環(huán)保[10]。同時(shí)調(diào)環(huán)酸鈣能維持和延長(zhǎng)體內(nèi)其他赤霉素的活性水平，有效防治作物早衰，具有一定的應(yīng)用前景[11-12]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)調(diào)環(huán)酸鈣的應(yīng)用技術(shù)研究主要針對(duì)控制水稻、花生、小麥等作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量[13-15]，部分學(xué)者開展過調(diào)環(huán)酸鈣對(duì)果樹增產(chǎn)的影響研究[16-17]，對(duì)于調(diào)環(huán)酸鈣在觀賞植物上的應(yīng)用研究資料[18-19]較少，更多的施用方法和效果還需要進(jìn)一步的探索。與國(guó)外相比，國(guó)內(nèi)對(duì)于調(diào)環(huán)酸鈣的應(yīng)用研究還比較單一，調(diào)環(huán)酸鈣的某些功效還存在很多疑慮，比如調(diào)環(huán)酸鈣對(duì)植物葉色、花期、坐果、果形、著色等方面的影響，存在不同甚至截然相反的結(jié)論，嚴(yán)重制約了調(diào)環(huán)酸鈣的推廣應(yīng)用。

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外在采用多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控小蒼蘭生長(zhǎng)發(fā)育上取得了一定的成果，但多數(shù)調(diào)節(jié)劑依然沒有很好地解決生產(chǎn)實(shí)踐問題。為了探討調(diào)環(huán)酸鈣應(yīng)用于小蒼蘭生長(zhǎng)調(diào)控的可能性，了解調(diào)環(huán)酸鈣調(diào)控小蒼蘭生長(zhǎng)發(fā)育的具體效果，本研究首次以小蒼蘭品種上農(nóng)紅臺(tái)閣為材料，用調(diào)環(huán)酸鈣水溶液浸泡種球的處理方式，研究調(diào)環(huán)酸鈣對(duì)小蒼蘭(莖基部組織)中主要代謝物的影響，以期為其推廣應(yīng)用提供必要的生理生化基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)植物材料為小蒼蘭園藝品種上農(nóng)紅臺(tái)閣(FreesiahybridaSN Hongtaigei)，花為深紅色，花蕊金黃色，半重瓣。選擇大小一致(周徑約 7.5 cm)、無病蟲害、無損傷的種球作為材料并稱重，2019年10月栽培于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)工程訓(xùn)練中心的玻璃溫室。試驗(yàn)所用的調(diào)環(huán)酸鈣為安陽全豐生物科技有限公司生產(chǎn)的有效成分含量為15%的可濕性粉劑。

1.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析

浸泡小蒼蘭種球的調(diào)環(huán)酸鈣水溶液濃度根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，從6種濃度處理中選擇了跟對(duì)照組相比，對(duì)小蒼蘭形態(tài)有明顯影響的一個(gè)濃度進(jìn)行試驗(yàn)，即1 600 mg/L。小蒼蘭種球使用調(diào)環(huán)酸鈣浸球處理8周后，采集經(jīng)1 600 mg/L調(diào)環(huán)酸鈣水溶液浸泡種球處理和清水浸泡種球處理的小蒼蘭植株的莖基部組織約100 mg(圖1)，樣品在使用80%甲醇提取，經(jīng)過甲氧基化和硅烷化后，用7890-5975型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，使用LECO Chroma TOF?Database Connection?optimized for Pegasus和MSD Chemstation Data Analysis Application軟件檢測(cè)，采用NIST 2011譜庫(kù)進(jìn)行檢索，使用核糖醇作為內(nèi)標(biāo)，以各化合物峰面積和內(nèi)標(biāo)核糖醇峰面積的比值代表各代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)的處理與分析

采用SIMCA 14.1軟件對(duì)代謝產(chǎn)物的含量變化進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。對(duì)分析得到的標(biāo)志性代謝物，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

從GC-MS總離子流色譜圖(圖2)中可以看出，在使用調(diào)環(huán)酸鈣進(jìn)行浸泡種球處理后，部分化合物的峰面積有所不同，在小蒼蘭中檢測(cè)到的化合物含量發(fā)生變化，說明調(diào)環(huán)酸鈣浸泡種球處理影響了小蒼蘭的新陳代謝，對(duì)小蒼蘭的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了一定影響。

根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)，通過比對(duì)分析，共篩選得到了166種化合物。其中有機(jī)酸78種、糖31種、糖醇8種、醇10種、氨基酸31種、多胺6種、無機(jī)酸2種(圖3)，各類化合物的相對(duì)含量分布見圖4。

未處理的小蒼蘭中，氨基酸相對(duì)含量所占比例最大(圖5)，在使用調(diào)環(huán)酸鈣浸泡種球后，氨基酸相對(duì)含量占比仍最大(圖6)。比較發(fā)現(xiàn)，使用調(diào)環(huán)酸鈣浸泡種球后，化合物相對(duì)含量總體呈下降趨勢(shì)，除多胺和無機(jī)酸相對(duì)含量有所增加外，有機(jī)酸、糖、糖醇、醇和氨基酸相對(duì)含量減少，其中有機(jī)酸和糖的相對(duì)含量變化最大，與對(duì)照相比分別下降了25.03%和24.62%(表1)。

2.1 有機(jī)酸類

在小蒼蘭中共檢測(cè)到78種有機(jī)酸，其中棕櫚酸的相對(duì)含量最高，調(diào)環(huán)酸鈣浸泡種球處理后，發(fā)現(xiàn)有58種有機(jī)酸的相對(duì)含量下降，其中下降超過20%的有機(jī)酸有38種，下降超過50%的有15種，有6種有機(jī)酸的相對(duì)含量下降超過70%。其余20種有機(jī)酸的相對(duì)含量則相對(duì)對(duì)照表現(xiàn)為上升，其中上升幅度超過20%的有機(jī)酸有6種，上升幅度超過50%的有機(jī)酸有2種。

2.2 糖類

共檢測(cè)到31種糖，調(diào)環(huán)酸鈣浸泡種球后，小蒼蘭中相對(duì)含量減少的有21種糖，其中下降幅度超過20%的有15種糖，下降幅度超過50%的有7種糖，有4種糖的相對(duì)含量下降幅度超過70%。有10種糖的相對(duì)含量增加，4種糖的相對(duì)含量增加超過60%。

2.3 糖醇、醇類

共檢測(cè)到8種糖醇類化合物和10種醇類化合物，這18種化合物在調(diào)環(huán)酸鈣處理后，共有4種糖醇和7種醇的相對(duì)含量減少，其余4種糖醇和3種醇的含量增加。

表1 調(diào)環(huán)酸鈣對(duì)小蒼蘭各類化合物相對(duì)含量的影響

2.4 氨基酸類

共檢測(cè)到31種氨基酸，與對(duì)照相比，調(diào)環(huán)酸鈣處理后22種氨基酸的相對(duì)含量下降，其中14種氨基酸的下降幅度超過20%。其余9種氨基酸在處理后相對(duì)含量增加。

2.5 多胺、無機(jī)酸類

檢測(cè)并鑒定確定的多胺類化合物有6種，無機(jī)酸有2種，它們的相對(duì)含量均不高，與對(duì)照相比，經(jīng)過調(diào)環(huán)酸鈣浸球處理后，共有4種多胺和1種無機(jī)酸的相對(duì)含量下降，剩余2種多胺和1種無機(jī)酸在處理后含量上升。

2.6 代謝產(chǎn)物的PLS-DA

圖7是代謝物總量變化的偏最小二乘判別分析得分圖，它顯示對(duì)照組和處理組都可以各自聚成一組，2組之間能夠較好地區(qū)分開，PLS-DA得分圖可以表示小蒼蘭在經(jīng)過調(diào)環(huán)酸鈣處理后，其代謝物在空間分布上的不同，說明調(diào)環(huán)酸鈣處理會(huì)造成小蒼蘭代謝產(chǎn)物相對(duì)含量發(fā)生變化。將模型建立定義的Y矩陣的變量隨機(jī)排列20次，得到相應(yīng)Q2作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過置換檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)R2=0.546，Q2=-0.086，Q2是負(fù)值，表明模型可靠，不存在過擬合現(xiàn)象(圖8)。

圖9是PLS-DA得到的小蒼蘭代謝產(chǎn)物相對(duì)含量的變異比率。在模型中，提取出2個(gè)主成分，模型參數(shù)為R2(Y1)=0.438 6，R2(Y2)=0.870 2。

采用PLS-DA對(duì)代謝產(chǎn)物的變異權(quán)重進(jìn)行分析，得出不同代謝物的變異權(quán)重參數(shù)值(variable importance in projection，VIP)，在代謝組學(xué)中，一般認(rèn)為VIP>1的變量可能為2組的差異代謝物。在小蒼蘭樣品中，共有27種化合物的VIP大于1，其中包括4種有機(jī)酸，VIP最高的乙酰氧肟酸與脲酶的合成有關(guān)，棕櫚酸與脂肪酸的代謝過程相關(guān)；在糖類中，VIP大于1的糖有7種，其中D-葡萄糖參與多種糖代謝和糖酵解的代謝活動(dòng)，在調(diào)環(huán)酸鈣處理后，相對(duì)含量只有對(duì)照的1/4；在糖醇類和醇類化合物中，共發(fā)現(xiàn)1種糖醇和1種醇VIP大于1，其中肌醇參與半乳糖代謝、抗壞血酸和藻酸鹽代謝和磷酸肌醇代謝等多種代謝途徑；VIP大于1的氨基酸數(shù)超過了總數(shù)的1/3，其中天冬酰胺的VIP是所有化合物中最大的，天冬酰胺、瓜氨酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸、L-天門冬氨酸、L-脯氨酸和L-蘇氨酸等7種氨基酸參與相關(guān)的氨基酸代謝途徑；磷酸的VIP也大于1，它參與光合作用、氧化磷酸化等過程(表2)。

表2 PLS-DA模型分析得出的調(diào)環(huán)酸鈣處理小蒼蘭的標(biāo)志性代謝物

3 討論與結(jié)論

在小蒼蘭樣品中共檢測(cè)出了166種化合物，分布于7大類，其中有機(jī)酸最多，經(jīng)調(diào)環(huán)酸鈣處理后含量差異較大的有機(jī)酸中，十二酸、9-十六烯酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸和含量最高的棕櫚酸均與脂肪酸的代謝過程有關(guān)，脂肪酸作為生物體的基本組成成分之一，具有重要的生理功能，它們是重要的能源物質(zhì)，同時(shí)也是一些信號(hào)分子的前體，與植物的細(xì)胞識(shí)別、組織免疫、抗逆性等有密切的關(guān)系[20]，這些相關(guān)代謝物的含量總體趨勢(shì)為減少，這可能與調(diào)環(huán)酸鈣處理后的生長(zhǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累變化有關(guān)，這也可能是調(diào)環(huán)酸鈣能夠抑制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的一個(gè)重要原因。

糖類是光合作用的初級(jí)產(chǎn)物，給植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供碳源和能量。在經(jīng)過調(diào)環(huán)酸鈣的處理后，絕大多數(shù)糖含量下降，說明調(diào)環(huán)酸鈣處理對(duì)糖類的合成和貯存有一定的負(fù)效應(yīng)。在含量下降幅度較大的糖中，D-半乳糖、D-葡萄糖和蜜二糖都與半乳糖的代謝有關(guān)，D-半乳糖和D-果糖均與氨基糖和核苷酸糖的代謝過程相關(guān)，而D-葡萄糖和D-果糖等與糖酵解過程有關(guān)，它們的含量下降意味著植物體糖代謝能力的下降，這也可能是調(diào)環(huán)酸鈣抑制植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的原因之一。

氨基酸與植物體內(nèi)碳、氮、硫等元素的循環(huán)密不可分[21]。在調(diào)環(huán)酸鈣處理后，共鑒定出31種氨基酸，且含量占比最高，意味著可能發(fā)揮著重要作用。比較發(fā)現(xiàn)，大部分氨基酸經(jīng)調(diào)環(huán)酸鈣處理后含量下降。在變化較大的氨基酸中，VIP最大的天冬酰胺參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等多種氨基酸的代謝途徑，谷氨酰胺、L-鳥氨酸、絲氨酸、L-丙氨酸、L-5氧脯氨酸和甘氨酸等氨基酸均參與多種氨基酸的代謝，其含量均有所下降。

糖醇是水化的碳水化合物，它與碳的轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存、能量的傳遞等密切相關(guān)，肌醇的VIP大于1，它是幾種糖的前體，因此它的含量變化也與糖類的變化相關(guān)；在無機(jī)酸的積累中，磷酸的VIP較高，其在調(diào)環(huán)酸鈣處理后含量略微下降，磷酸在氧化磷酸化和光合作用過程中發(fā)揮重要的作用，對(duì)植物能量的轉(zhuǎn)換和物質(zhì)的合成可能有緊密的關(guān)系。

本研究采用調(diào)環(huán)酸鈣對(duì)盆栽小蒼蘭進(jìn)行浸泡種球處理，并對(duì)小蒼蘭代謝物相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與分析，GC-MS分析共鑒定出166種化合物，各類化合物的相對(duì)含量不等，以氨基酸最高。調(diào)環(huán)酸鈣處理后，除多胺和無機(jī)酸的相對(duì)含量有所增加外，有機(jī)酸、糖、糖醇、醇和氨基酸的相對(duì)含量均減少。其中有機(jī)酸和糖的相對(duì)含量變化最大，與對(duì)照相比分別下降了25.03%和24.62%，與脂肪酸代謝相關(guān)的十二酸、9-十六烯酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸等的含量下降，可能是調(diào)環(huán)酸鈣調(diào)節(jié)生長(zhǎng)過程的環(huán)節(jié)之一；與糖酵解相關(guān)的多種糖和參與碳代謝的肌醇含量下降，植株糖代謝能力下降，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成和貯存減少；多數(shù)氨基酸含量變化明顯，影響植物的信息傳導(dǎo)、氨基酸代謝、嘧啶和嘌呤代謝以及谷胱甘肽代謝過程；參與多種氨基酸代謝的尸胺和參與光合作用的磷酸是多種化合物合成的前體，它們含量的升高意味著相關(guān)物質(zhì)合成的減弱，這些結(jié)果為解析調(diào)環(huán)酸鈣調(diào)控小蒼蘭生長(zhǎng)發(fā)育提供了生理生化基礎(chǔ)，為后續(xù)調(diào)環(huán)酸鈣應(yīng)用于小蒼蘭生產(chǎn)實(shí)踐提供了依據(jù)。