陳喜宏，余世田，馬 驍，路桂聰，王瑞宏，玉永雄，蔣曹德*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 北碚 400715；2.城口縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)，重慶 城口 405999)

牛乳腺炎是一種奶牛乳腺組織感染的頑固性疾病，其發(fā)病率高、治愈率低、淘汰率高。國(guó)內(nèi)外奶牛場(chǎng)由于乳腺炎造成了乳制品產(chǎn)量和品質(zhì)下降、治療成本和牧場(chǎng)管理費(fèi)用飆升，乳腺炎已成為限制全球奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最重要原因之一[1]。當(dāng)前奶牛乳房炎普遍采用抗生素療法，不僅導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且乳汁中抗生素殘留嚴(yán)重危害人類健康。植物提取物富含天然活性物質(zhì)，具有無(wú)殘留、無(wú)抗藥性、多功能等優(yōu)勢(shì)，已廣泛用作畜禽飼料添加劑[2]。研究植物提取物的抗炎作用，對(duì)于探討奶牛乳房炎的抗生素替代療法具有重要的理論和實(shí)踐意義。

前期研究表明核因子κB(NF-κB)為經(jīng)典的炎性反應(yīng)通路，革蘭陰性菌脂多糖(LPS)被toll 樣受體4(TLR4) 識(shí)別后，激活NF-κB激酶(IKK)，導(dǎo)致NF-κB抑制蛋白(IκB)磷酸化和泛素化，從而釋放NF-κB p65亞基并進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)炎性因子與炎性介導(dǎo)因子的表達(dá)，其中包括白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧酶2(COX-2)等[3]。其他研究報(bào)道了促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路通過(guò)MAPK激酶的激酶—MAPK激酶—細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、C-Jun 氨基端激酶(JNK1/2)和p38級(jí)聯(lián)調(diào)控NF-κB、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧酶2(COX-2)等的表達(dá)[4-5]。MAPK和NF-κB信號(hào)通路在炎癥發(fā)生中的重要作用已在小鼠乳腺上皮細(xì)胞[6-9]、RAW264.7細(xì)胞[10]、BV-2細(xì)胞[11]、人單核細(xì)胞[12]中得到廣泛的證實(shí)。

芹菜素(apigenin，Api)即4′,5,7-三羥基黃酮，是一種天然的黃酮類物質(zhì)[3]。芹菜素的抗炎抗氧化功能相繼報(bào)道于小鼠結(jié)腸腫瘤與上皮細(xì)胞、牛的內(nèi)皮細(xì)胞[13-15]。其他研究還揭示了芹菜素對(duì)NF-κB p65磷酸化、iNOS和COX-2的抑制作用[16-17]。目前在小鼠上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞中的研究集中在芹菜素的抗炎抗氧化作用，但是芹菜素對(duì)于MAPK通路和NF-κB通路的關(guān)鍵成員以及牛乳腺炎發(fā)生的調(diào)控功能還不清楚。因此，本研究選擇牛的乳腺上皮細(xì)胞MAC-T和BME-UV1以及小鼠乳腺組織，分析芹菜素對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其抗炎的分子通路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)MAC-T細(xì)胞(BMCC，CHN)培養(yǎng)于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Hyclone,Logan,SH30022.FS USA)含有10% FBS(Gibco，AUS)，1% 青鏈霉素和100 mg/L的鏈霉素(Solarbio，P1400-100 北京)；培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2(Forma Series 3 WJ,Thermo,USA)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到90%時(shí)用0.25%胰酶(Solarbio,CAS:9002-07-7 北京)消化并傳代。

1.2 細(xì)胞活性檢測(cè)MAC-T細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96孔板上。待細(xì)胞貼壁后添加不同質(zhì)量濃度(0，1，5，10，25，50，100，200 mg/L)的芹菜素(MCE，CAS No.:520-36-5,USA)處理并設(shè)置5個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后將上清液棄去并加入10 μL MTT(Solarbio，CHN)和90 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后，棄去培養(yǎng)液，再加入110 μL Formazan(Solarbio,CAS:298-96-4 北京)共同孵育10 min，用光密度計(jì)(Multiskan GO，Thermo，USA)檢測(cè)D490 nm值。細(xì)胞活性=(處理組D值/對(duì)照組D值)×100%。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn)選取30只(20只雌性和10只雄性)6～8周齡BALB/c小鼠(伯恩斯韋爾生物技術(shù)有限公司，重慶)進(jìn)行自由采食飼養(yǎng)。試驗(yàn)前采用在12 h光照與黑暗交替、無(wú)病原體條件下飼養(yǎng)1周。然后，每只籠子里飼養(yǎng)2只母鼠和1只公鼠進(jìn)行交配。在母鼠分娩7 d后，將哺乳期的母鼠隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組、LPS組(10 μg)、LPS+Api (15 mg)和Api+LPS[18]。LPS (200 mg/L，50 μL)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用32G針注射到最容易觀察和采集的第4對(duì)乳頭(R4和L4)的乳腺導(dǎo)管中[9,18]。LPS組的每只哺乳期小鼠用9 μL 4%水合氯醛深度麻醉，在脂多糖滴注前、后1 h腹腔注射芹菜素[9]?？瞻讓?duì)照組和LPS組腹腔注射等體積的PBS。注射LPS 24 h后[18]，通過(guò)頸椎脫臼處死小鼠，收集乳腺組織并儲(chǔ)存在-80℃。

1.4 總RNA的提取與real-time PCR MAC-T細(xì)胞按照2×106/孔接種于6孔板中，貼壁后按照不同實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不同處理。為篩選LPS處理的最佳時(shí)間與質(zhì)量濃度，MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)在含有不同質(zhì)量濃度LPS(Acmec，AL8880 CHN)(0，1，5，10，20 mg/L)的培養(yǎng)液中，并在1，12和24 h分別收集細(xì)胞，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。對(duì)于芹菜素的處理，MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)在含有不同質(zhì)量濃度芹菜素(0(陰性對(duì)照)，1，7和15 mg/L)和1 mg/L LPS的培養(yǎng)液中，并以20 mg/L DEX(dexamethasone)(Macklin，D807084 CHN)和1 mg/L LPS共處理作為陽(yáng)性對(duì)照。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。各種處理收集的細(xì)胞均用PBS潤(rùn)洗3次，每孔加入600 μL RNAiso plus(TaKaRa，D9108A JPN)充分裂解后轉(zhuǎn)移至無(wú)核酶離心管中，加入1/5 RNAiso plus體積的氯仿，充分混勻后室溫靜置5 min；4℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的無(wú)核酶離心管，加入等體積異丙醇后混勻并于-20℃沉淀30 min；4℃ 12 000 r/min離心10 min 收集RNA沉淀，75%乙醇清洗RNA沉淀2次后干燥，并加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop One，Thermo，USA)測(cè)定RNA濃度。

按照mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(江蘇楚天生物科技有限公司，常州)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (寶生物工程(大連)有限公司)在CFX96(Bio-Rad，USA)熱反應(yīng)儀上進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。除了各引物退火溫度見(jiàn)表1，real-time PCR反應(yīng)體系、熱循環(huán)程序和60～95℃熔融曲線分析參照文獻(xiàn)[19]。每個(gè)PCR反應(yīng)3次重復(fù)，以β- actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[20-21]。

表1 熒光定量引物序列

1.5 Western blotMAC-T 細(xì)胞按照2×106/孔接種于6孔板中待其貼壁，隨后培養(yǎng)在含有不同質(zhì)量濃度芹菜素(0，1，7和15 mg/L)和1 mg/L LPS的培養(yǎng)液中，24 h后收集細(xì)胞。細(xì)胞總蛋白提取采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒(Solarbio，R0020 北京)，隨后用BCA蛋白定量試劑盒(Vazyme，ml058939 南京)進(jìn)行總蛋白定量。取4 μL蛋白樣品加入16 μL上樣緩沖液(Solarbio，P1040 北京)后煮沸變性5 min，隨后采用10% SDS-PAGE(PowerPac HC，Bio-Rad，USA)。電泳條帶通過(guò)轉(zhuǎn)印設(shè)備(1703812，Bio-rad，USA)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Biosharp，AP-4796 上海)，在含有5%牛血清白蛋白(Biotopped，北京)的封閉液中室溫封閉1 h后，進(jìn)一步與一抗4℃孵育過(guò)夜，其中一抗包括β-actin(bsm-33036M；稀釋比1∶10 000)，p65(bs-23217R，稀釋比1∶1 000)，p-p65(bs-0982R，稀釋比1∶1 000)，IκBα(bs-1287R；稀釋比1∶1 000)，p-IκBα(bs-2513R，稀釋比1∶1 000)，ERK1/2(bs-2637R，稀釋比1:1 000)，p-ERK1/2(bs-3016R，稀釋比1:1 000)(Bioss，北京)以及JNK1/2(WL01295，稀釋比1∶750)，p-JNK1/2(WL01813C，稀釋比1∶750)，p38(WL00764，稀釋比1∶750)和p-p38(WLP1576，稀釋比1∶750)(Wanleibio，沈陽(yáng))。上述一抗雜交膜經(jīng)TBST洗滌3次后，與特異性二抗(AB501-01A，Novoprotein，北京)室溫孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Gel Doc XR，Bio-Rad，USA)檢測(cè)目標(biāo)條帶，并使用Image Lab (version 5.2.1,Bio-Rad,USA)和GraphPad Prism(version 8.2)進(jìn)行定量分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，以20 mg/LDEX和1 mg/L LPS共處理作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 免疫細(xì)胞熒光將MAC-T細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96孔板并設(shè)置5個(gè)重復(fù)，待其貼壁后將MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)在含有不同質(zhì)量濃度芹菜素(0(陰性對(duì)照)，1，7，15 mg/L)和1 mg/L LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，并以20 mg/L DEX和1 mg/L LPS共處理作為陽(yáng)性對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，PBS潤(rùn)洗3次，免疫染色固定液固定10 min；PBS洗滌3次，免疫染色封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(p-p65和 p-IκB)4℃孵育過(guò)夜；加入Cy3標(biāo)記的二抗即羊抗兔免疫球蛋白(SN368，Beyotime，上海)室溫孵育1 h，用PBS洗滌3次后加入20 μL細(xì)胞核染色液DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色10 min；用PBS洗滌3次加入適量免疫染色封片液，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)于炎癥細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激因子的檢測(cè)，使用無(wú)菌注射器從4個(gè)治療組的小鼠中提取5 mL血液，儲(chǔ)存在10 mL含有0.1 mL肝素鈉(10 g/L鹽水溶液)的離心管中，并在4℃下以3 000 r/min離心30 min。為了測(cè)試p-p65核轉(zhuǎn)移，在6孔板中培養(yǎng)和處理MAC-T和BME-UV1細(xì)胞，使用核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒(Vazyme，ml058939 南京)進(jìn)行定量。采用酶聯(lián)免疫試劑盒(游喧，上海)檢測(cè)血液上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量，以及細(xì)胞核中p-p65的含量。每個(gè)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)進(jìn)行3次。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)MAC-T細(xì)胞活性的影響隨著芹菜素處理濃度的增加，MAC-T細(xì)胞活性表現(xiàn)為先提高后下降，在芹菜素質(zhì)量濃度為7 mg/L時(shí)細(xì)胞增殖顯著高于其他質(zhì)量濃度(P<0.01)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)20 mg/L時(shí)細(xì)胞增殖顯著下降(P<0.05)。因此，確定芹菜素的適宜處理質(zhì)量濃度為1～15 mg/L。

圖1 芹菜素處理對(duì)MAC-T細(xì)胞活性的影響

2.2 LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞炎癥反應(yīng)為篩選引起炎癥反應(yīng)的LPS質(zhì)量濃度，分析了不同質(zhì)量濃度的LPS處理組和未處理對(duì)照組MAC-T細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)水平。與處理1～24 h后的對(duì)照相比，在用1～20 mg/L LPS處理的MAC-T細(xì)胞中，IL-6轉(zhuǎn)錄水平具有劑量和時(shí)間依賴性 (P<0.01，圖2A)。而且，在1 mg/L LPS處理的細(xì)胞中，IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01,圖2B-F)。因此，根據(jù)文獻(xiàn)選擇1 mg/L LPS進(jìn)行后繼研究[20]。

2.3 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAC-T炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激的抑制作用為檢測(cè)芹菜素的抗炎和抗氧化作用，采用不同質(zhì)量濃度的芹菜素和1 mg/LLPS共處理MAC-T細(xì)胞。如圖2所示，1，7 和15 mg/L 3種質(zhì)量濃度的Api處理均顯著降低了LPS誘導(dǎo)的COX-2、iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)量，而且除TNF-α(P>0.05)外，其他細(xì)胞因子的表示水平也顯著低于DEX處理組(P<0.01，圖2B-F)。

注：圖A中不同大寫(xiě)字母表示P<0.01，相同大寫(xiě)字母之間表示P<0.05；圖B中#和##分別表示與空白對(duì)照組比較P<0.05 和P<0.01，*和**分別表示與LPS處理組比較P<0.05和P<0.01。下同

2.4 芹菜素對(duì)MAC-T細(xì)胞NF-kB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白磷酸化的抑制利用Western blot檢測(cè)了芹菜素對(duì)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵成員p65和IκBα的磷酸化的影響(圖3)。與對(duì)照組相比，LPS處理后MAC-T細(xì)胞p65和IκBα蛋白質(zhì)水平?jīng)]有差異(圖3A)，但是它們的磷酸化顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3B、C)。相反，1，7，15 mg/L的芹菜素處理均極顯著下調(diào)了LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞p65和的磷酸化水平(P<0.01)，而且芹菜素對(duì)p-p65和p-IκBα抑制程度呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。各質(zhì)量濃度芹菜素處理后，p-p65和p-IκBα水平也顯著低于DEX處理組(P<0.05)。同樣，LPS與LPS共處理可顯著降低BME-UV1細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的p-IκB和p-p65水平(P<0.01)。

A.Western blot結(jié)果；B～C.不同質(zhì)量濃度芹菜素處理24 h后LPS誘導(dǎo)的p65和IκBα磷酸化蛋白表達(dá)量

進(jìn)一步檢測(cè)了芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)移的影響(圖4)。在對(duì)照組(Control)中，p65蛋白主要集中在細(xì)胞質(zhì)中(圖4A～C)；經(jīng)過(guò)LPS處理后，p65蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核(圖4D～F)。相反，芹菜素與LPS共處理后，3種質(zhì)量濃度的芹菜素(1，7，15 mg/L)處理均能抑制p65核轉(zhuǎn)移(圖4J-R)。

圖中藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，紅色熒光為p65蛋白；Merge為紅色和藍(lán)色熒光疊加

2.5 芹菜素對(duì)MAC-T細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化的抑制前期文獻(xiàn)報(bào)道MAPK是激活NF-κB和促炎調(diào)節(jié)因子的關(guān)鍵級(jí)聯(lián)通路[6]，因此檢測(cè)了芹菜素對(duì)MAPK通路關(guān)鍵成員p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平的影響(圖5)。LPS處理后，p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平較陰性對(duì)照組都有極顯著的提高(P<0.01)(圖5B-D)。然而，1，7，15 mg/L芹菜素處理后，上述3個(gè)蛋白激酶的磷酸化水平極顯著下降(P<0.01)，其中p38的磷酸化下降程度呈現(xiàn)芹菜素劑量依賴效應(yīng)(圖5B)，并且p38和ERK1/2的磷酸化在各種質(zhì)量濃度芹菜素處理下都顯著低于DEX處理(P<0.01)(圖5B、D)。

圖5 芹菜素對(duì)MAPK信號(hào)通路的抑制

2.6 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎性細(xì)胞因子與氧化應(yīng)激因子表達(dá)的抑制利用小鼠乳腺探討了芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及NF-κB和MAPK通路的影響。ELISA分析顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS顯著提高了促炎細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)和氧化應(yīng)激因子(COX-2和iNOS)的血液蛋白水平(P<0.05，圖6)，但是芹菜素前處理(Api + LPS)和后處理(LPS + Api)均極顯著下調(diào)了5種細(xì)胞因子的表達(dá)(P<0.01)。Western blot顯示，芹菜素前處理與后處理均顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB磷酸化水平(p-IκB和p-p65)(P<0.05，圖7)和MAPK磷酸化 (p-p38、p-JNK1/2和P-ERK1/2)(P<0.05，圖8)。這些結(jié)果與體外結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了芹菜素的抗炎作用。

圖6 芹菜素對(duì)小鼠炎癥反應(yīng)的影響

圖7 芹菜素對(duì)小鼠NF-κB通路的影響

圖8 芹菜素對(duì)小鼠MAPK信號(hào)通路的影響

3 討論

本研究利用LPS處理MAC-T細(xì)胞揭示芹菜素的抗炎作用。MAC-T細(xì)胞是表達(dá)猴病毒-40的大T抗原的牛乳腺上皮細(xì)胞，由于其與原代細(xì)胞具有相似的生物學(xué)反應(yīng)，常被用作研究牛乳腺炎癥的模型[20]。因此，本研究選擇該細(xì)胞系來(lái)研究芹菜素對(duì)MAC-T細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是引起牛乳腺炎常見(jiàn)的病原體，但是大腸桿菌引發(fā)急性臨床癥狀，并激活機(jī)體免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞因子和趨化因子等的表達(dá)[6,21]。LPS是大腸桿菌細(xì)胞壁的主要成分，通過(guò)TLR4/NF-κB級(jí)聯(lián)激活炎癥反應(yīng)[22]。另一方面，DEX是一種廣泛用于治療人類炎癥性疾病以及LPS誘導(dǎo)的動(dòng)物模型和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的類固醇藥物。因而，本研究建立了空白、LPS和LPS + DEX對(duì)照，通過(guò)LPS組與空白對(duì)照組比較，揭示LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；通過(guò)比較LPS +Api、LPS + Api與LPS、LPS + DEX處理差異，揭示芹菜素的抗炎作用。

研究表明LPS激活TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致牛乳腺腺組織嚴(yán)重?fù)p傷[6,23]。在RAW264.7、腎小管上皮細(xì)胞和腸道炎癥疾病中的研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能降低LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)[6,17,24]。本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素不僅降低LPS誘導(dǎo)的IL-1β和IL-6的表達(dá)，而且還抑制了炎癥介導(dǎo)因子COX-2和iNOS的表達(dá)(圖3)，這與芹菜素在HepG2細(xì)胞炎癥和前列腺癌細(xì)胞中降低COX-2和iNOS的mRNA水平相一致[25-26]。實(shí)際上，COX-2是一種誘導(dǎo)酶，其表達(dá)受IL-1、IL-6等細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)控，該炎性介導(dǎo)因子的表達(dá)是前列腺素刺激的關(guān)鍵步驟[27]。iNOS是一種一氧化氮合酶，被炎癥、組織損傷等病理刺激激活，抑制iNOS對(duì)降低炎癥介質(zhì)NO水平至關(guān)重要[27]。因此，COX-2和iNOS均是炎癥標(biāo)志物，它們的表達(dá)與氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中數(shù)據(jù)表明，芹菜素的抗氧化和抗炎作用是通過(guò)下調(diào)IL-6、IL-1β、iNOS和COX-2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

NF-κB在LPS誘導(dǎo)的肺部和巨噬細(xì)胞炎癥中起著關(guān)鍵作用[18-19]。桑色素、荷葉堿和皂苷等植物提取物通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)發(fā)揮炎癥的抑制作用[5,28-29]。NF-κB是細(xì)胞中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，主要由p50和p65復(fù)合物組成，在靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白IκBα結(jié)合而失去活性[22]。LPS刺激后，IκBα通過(guò)磷酸化和泛素化被降解并釋放p-p65，隨后遷移到細(xì)胞核參與COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β等靶基因的轉(zhuǎn)錄激活[23]。有研究報(bào)道，在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中，芹菜素能抑制p-p65和p-IκB的表達(dá)量以及p-p65的核積累[30]，但過(guò)表達(dá)IKK能解除芹菜素對(duì)NF-κB p65磷酸化的抑制[30]。本研究從體外和在體研究均發(fā)現(xiàn)芹菜素能顯著降低p-IκBα和p-p65水平以及p-p65核移位(圖4、7)。這些結(jié)果說(shuō)明芹菜素能通過(guò)抑制IκBα降解和p65激活減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

已有文獻(xiàn)表明MAPK信號(hào)通路通過(guò)iNOS、COX-2等炎性介導(dǎo)因子促進(jìn)炎性細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)[6,30]。MAPK信號(hào)包含3個(gè)MAP激酶，即ERK1/2、JNK1/2和p38，這些酶存在于所有的真核細(xì)胞中。本研究中，芹菜素抑制了MAC-T細(xì)胞炎癥中p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38水平(圖5、8)，此研究結(jié)果證實(shí)了小鼠、大鼠以及HK-2細(xì)胞中的研究結(jié)果[32-34]，說(shuō)明芹菜素的抗氧化活性與MAPK信號(hào)通路活性的抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究表明芹菜素能降低MAC-T細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和炎性介導(dǎo)因子COX-2、iNOS的表達(dá)；芹菜素通過(guò)抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路抑制MAC-T細(xì)胞炎性反應(yīng)，但是其奶牛乳腺炎防治中的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。