程一丹，張西臣，張洪波，李建華，宮鵬濤，王曉岑，李 新，張 楠

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

人五毛滴蟲(Pentatrichomonashominis)是一種新發(fā)現(xiàn)的潛在人獸共患腸道原蟲，臨床上可引起腹瀉、腹痛、食欲減退等癥狀[1]。人五毛滴蟲感染呈世界性分布，感染宿主廣，可感染人、犬、貓、非人靈長類及嚙齒類動(dòng)物等[1-5]。近年來ZHANG等[6]發(fā)現(xiàn)人五毛滴蟲感染還與胃腸道癌有高度關(guān)聯(lián)性。因此，防治人五毛滴蟲病已經(jīng)成為不容忽視的問題。

臨床上對(duì)感染人五毛滴蟲的患者常用口服甲硝唑[1]和替硝唑[7]的方法進(jìn)行治療，但其毒副作用較大且存在一定程度的耐藥性，因此尋找高效、低毒的抗人五毛滴蟲新藥勢(shì)在必行。目前，已有研究報(bào)道蛇床子素在體外對(duì)人五毛滴蟲的殺傷作用[8]，未見硝唑尼特和苦參堿抗人五毛滴蟲作用的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)選用苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特3種藥物分別在體內(nèi)和體外研究抗人五毛滴蟲的作用效果，為尋找抗人五毛滴蟲新的藥物防治該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株人五毛滴蟲蟲株(ATCC30000)由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，3～4周齡，雌性60只，購于北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑苦參堿，購于上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%)，批號(hào)S31035；蛇床子素，購于上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%)，批號(hào)S26004；硝唑尼特，南雄陽普醫(yī)療科技有限公司(純度≥99%)，批號(hào)210501。

1.4 人五毛滴蟲滋養(yǎng)體的體外純培養(yǎng)將凍存于液氮中的人五毛滴蟲復(fù)蘇，參照CHAO等[9]的方法，應(yīng)用TYI-S-33培養(yǎng)基在37℃條件下無菌培養(yǎng)，待生長至對(duì)數(shù)期后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)將取1 mL 蟲體加入新的培養(yǎng)管中，并加入新鮮培養(yǎng)基。

1.5 不同質(zhì)量濃度苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲的體外殺傷作用待人五毛滴蟲培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，將蟲體濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。將40 g/L苦參堿溶液(溶劑為蒸餾水)、40 g/L蛇床子素溶液(溶劑為無水乙醇)、2 g/L的硝唑尼特溶液(溶劑為DMSO)，加入蟲體中，設(shè)置空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組?？鄥A和蛇床子素終質(zhì)量濃度梯度為4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 g/L，硝唑尼特的終質(zhì)量濃度梯度分別為10.000，5.000，2.50，1.250，0.625 mg/L。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h分別對(duì)各培養(yǎng)管中蟲體數(shù)量進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

1.7 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特作用人五毛滴蟲的透射電鏡觀察以苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特3種藥物的最適質(zhì)量濃度處理10 h后收集蟲體進(jìn)行透射電鏡樣品制作，同時(shí)設(shè)立無藥物對(duì)照組。離心棄上清，用PBS洗滌3次，3 500 r/min離心10 min，去上清，2.5%戊二醛固定液加入沉淀固定1 h以上。將樣品送至吉林大學(xué)人獸共患病研究所電鏡室，進(jìn)行1%餓酸固定、脫水、超薄切片等制樣步驟。待樣品制備完成后置于HITACHI H-7650透射電境下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。

1.8 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人工感染人五毛滴蟲小鼠的體內(nèi)殺傷作用每只BALB/c小鼠經(jīng)口灌服人五毛滴蟲1×106個(gè)。將感染成功的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為11組，每組5只。第1～3組為硝唑尼特用藥組：用藥劑量分別為0.5，1.0，2.0 mg/kg；第4～6組為蛇床子素用藥組：用藥劑量分別為25.0，50.0，100.0 mg/kg；第7～9組為苦參堿用藥組：用藥劑量分別為25.0，50.0，100.0 mg/kg；第10組為感染不用藥組；第11組為不感染不用藥組。各組小鼠分別經(jīng)口灌服相應(yīng)劑量藥物，每天1次，連續(xù)灌服3 d。收取各組小鼠糞便并提取糞便基因組，參考人五毛滴蟲18S rRNA 基因的特異性引物[10](Ph1:5′-ATGGCGAGTGGTGGAATA-3′,Ph2:5′-CCCAA-CTACGCTAAGGATT-3′；Th3:5′-TGTAAACG-ATGCCGACAGAG-3′,Th5:5′-CAACACTGA-AGCCAATGCGAGC-3′)，應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增以檢測(cè)藥物對(duì)人五毛滴蟲的殺傷作用。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲的體外殺傷作用培養(yǎng)24 h后，苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特在不同質(zhì)量濃度作用下的人五毛滴蟲密度見表1，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3種藥物均能夠抑制人五毛滴蟲的生長繁殖，且隨著藥物質(zhì)量濃度的升高，對(duì)蟲體生長繁殖的抑制作用也出現(xiàn)相應(yīng)的增強(qiáng)。在藥物作用蟲體24 h后，4 g/L苦參堿和10 mg/L硝唑尼特均可完全殺滅人五毛滴蟲，4 g/L蛇床子素對(duì)人五毛滴蟲的殺傷作用可達(dá)到96.2%，光學(xué)顯微鏡下仍可看到活動(dòng)蟲體。

表1 不同質(zhì)量濃度苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲的體外殺傷作用

2.2 不同作用時(shí)間苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲的體外殺傷作用以4 g/L苦參堿用藥2 h后，50%以上的蟲體失去活力，12 h可殺死全部蟲體(圖1A)。而4 g/L蛇床子素在作用8 h后，藥物組蟲體數(shù)量減少不顯著，在24 h時(shí)不能殺死全部蟲體(圖1B)，與同質(zhì)量濃度苦參堿相比，作用效果較差。10 mg/L硝唑尼特在作用18 h時(shí)，蟲體全部死亡(圖1C),人五毛滴蟲的死亡率隨著藥物作用時(shí)間的延長而增加。

A.苦參堿處理組；B.蛇床子素處理組；C.硝唑尼特處理組

2.3 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特作用人五毛滴蟲的透射電鏡觀察透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，人五毛滴蟲經(jīng)4 g/L苦參堿處理后，滋養(yǎng)體腫脹，胞質(zhì)內(nèi)部分空泡化(圖2A)。由4 g/L蛇床子素處理的人五毛滴蟲滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)完整，核膜邊緣不清晰，胞質(zhì)內(nèi)容物稀疏，多聚核糖體解聚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒(圖2B)。經(jīng)10 mg/L硝唑尼特處理后，人五毛滴蟲滋養(yǎng)體胞質(zhì)內(nèi)空化，核膜、胞膜崩解(圖2C)。而對(duì)照組蟲體橫切面外觀結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整(圖2D)。

A.苦參堿作用人五毛滴蟲滋養(yǎng)體10 h后的形態(tài)；B.蛇床子素作用人五毛滴蟲滋養(yǎng)體10 h后的形態(tài)；C.硝唑尼特作用人五毛滴蟲滋養(yǎng)體10 h后的形態(tài)；D.無藥物正常組人五毛滴蟲滋養(yǎng)體。N.細(xì)胞核；G.高爾基體；H.氫化體；C.肋；RF.波動(dòng)膜；AF.前鞭毛

2.4 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人工感染人五毛滴蟲小鼠的體內(nèi)殺傷作用經(jīng)口灌服人五毛滴蟲滋養(yǎng)體后小鼠全部感染。經(jīng)硝唑尼特低劑量組0.50 mg/kg和蛇床子素低劑量組25.0 mg/kg進(jìn)行處理后，仍可擴(kuò)增到人五毛滴蟲，糞便及腸道灌洗液鏡檢可見蟲體。而經(jīng)硝唑尼特1.0,2.0 mg/kg劑量組、蛇床子素50.0,100.0 mg/kg劑量組和苦參堿25.0,50.0,100.0 mg/kg 劑量組治療后，PCR和鏡檢均未檢測(cè)到人五毛滴蟲。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中硝唑尼特、苦參堿和蛇床子素的最低作用劑量分別為1.0，25.0,50.0 mg/kg(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1～3.硝唑尼特0.5，1.0，2.0 mg/kg劑量組；4～6.蛇床子素25.0，50.0，100.0 mg/kg劑量組；7～9.苦參堿25.0，50.0，100.0 mg/kg劑量組；10.感染不用藥組； 11.不感染不用藥組；12.陽性對(duì)照；13.陰性對(duì)照

3 討論

目前，臨床上針對(duì)毛滴蟲病一般采用硝基咪唑類藥物進(jìn)行治療?？谷宋迕蜗x病的藥物通常選用化學(xué)藥物，如甲硝唑和替硝唑。連續(xù)口服5 d劑量為60 mg/kg的甲硝唑[11]或連用口服14 d劑量為30 mg/kg的替硝唑[7]可治療貓人五毛滴蟲病。但有報(bào)道顯示，在人五毛滴蟲感染貓的病例中，口服甲硝唑治療效果不明顯，替換藥物為羅硝唑后糞便干燥恢復(fù)正常[12]，說明甲硝唑表現(xiàn)出耐藥性的問題。因此尋找高效、低毒的抗人五毛滴蟲新藥勢(shì)在必行。

硝唑尼特是一種新的廣譜抗寄生蟲藥物，在人醫(yī)上該藥獲準(zhǔn)用于治療幼兒和成人的賈第蟲和隱孢子蟲感染[13]，但并未見臨床上應(yīng)用硝唑尼特治療感染人五毛滴蟲患者的報(bào)道。有相關(guān)研究顯示，硝唑尼特對(duì)豬三毛滴蟲和陰道毛滴蟲有殺滅作用[14-15]，但并沒有對(duì)人五毛滴蟲的抑制效果進(jìn)行研究。孟瑩等[16]研究發(fā)現(xiàn)，硝唑尼特可殺滅豬三毛滴蟲，在24 h 時(shí)其最小抑制質(zhì)量濃度為12.5 mg/L。本試驗(yàn)與其報(bào)道的作用效果類似，當(dāng)硝唑尼特用藥量為10 mg/L 時(shí)，在18 h可殺死全部蟲體，殺蟲效果顯著。

近年來，中草藥抗人五毛滴蟲的研究取得了很大進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，5 g/L的白頭翁水浸膏組作用48 h可殺滅全部人五毛滴蟲[16]；黃連、雞冠花、金蓮花和青蒿在最低有效質(zhì)量濃度分別為5，5，20，8 g/L時(shí)，均可殺滅人五毛滴蟲[8]。以上藥物對(duì)人五毛滴蟲的作用效果均只進(jìn)行了體外試驗(yàn)，但體內(nèi)治療效果如何并沒有進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)就中草藥提取物苦參堿和蛇床子素對(duì)人五毛滴蟲的體內(nèi)外作用效果進(jìn)行研究。

苦參堿對(duì)陰道毛滴蟲和鴿毛滴蟲都有著良好的抑制及殺滅作用[17-18]，但對(duì)人五毛滴蟲的具體藥理作用及抑殺人五毛滴蟲的作用程度研究尚不明確。趙瑞等[17]報(bào)道，苦參堿用量100～400 mg/L，對(duì)陰道毛滴蟲具有明顯的抑殺作用。而本試驗(yàn)中使用的苦參堿質(zhì)量濃度最小為0.25 g/L，對(duì)人五毛滴蟲也有著顯著的抑殺作用，蟲體死亡率接近50%。體內(nèi)試驗(yàn)中在苦參堿以25 mg/kg的劑量治療人工感染人五毛滴蟲的小鼠后，經(jīng)腸道灌洗液、糞便鏡檢和巢式PCR擴(kuò)增確定已清除小鼠體內(nèi)蟲體。

蛇床子作為常見中草藥，成本低廉，毒性低，有著廣闊的發(fā)展前景，其對(duì)鴿毛滴蟲和陰道毛滴蟲有很好的抑制效果[19-20]。陳海華等[19]發(fā)現(xiàn)蛇床子素在5 g/L時(shí)，12 h可殺滅全部鴿毛滴蟲；蛇床子素對(duì)陰道毛滴蟲的最低抑制質(zhì)量濃度為1.12 g/L[20]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在4 g/L質(zhì)量濃度的蛇床子素作用于人五毛滴蟲24 h，殺蟲率達(dá)到97.88%，其與李永秀等[8]的研究結(jié)果相似，其4 g/L質(zhì)量濃度組蛇床子素在體外試驗(yàn)中并不能完全殺滅人五毛滴蟲，但有顯著的抑制作用。但李永秀等[8]并未進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，而在本試驗(yàn)的體內(nèi)試驗(yàn)中50 mg/kg劑量的蛇床子素有著良好的治療效果，PCR和鏡檢均未檢測(cè)到人五毛滴蟲。

本研究采用透射電鏡技術(shù)對(duì)苦參堿和蛇床子素和硝唑尼特處理后的人五毛滴蟲進(jìn)行觀察。對(duì)照組蟲體橫切面外觀結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，與HONIGBERG 等[21]描述的人五毛滴蟲結(jié)構(gòu)基本相同。而在苦參堿和蛇床子素處理后的人五毛滴蟲，均表現(xiàn)出多聚核糖體解聚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒的現(xiàn)象，這與閆艷等[22]所觀察到白頭翁體外抗陰道毛滴蟲的透射電鏡結(jié)果相似。表明蟲體的蛋白合成可能受到影響，胞核無法維持正常功能，進(jìn)一步影響蟲體生長繁殖。而硝唑尼特作用后的人五毛滴蟲胞質(zhì)均從破損的細(xì)胞膜處溢出，與雙氫青蒿素作用后的陰道毛滴蟲形態(tài)相似[23]，陰道毛滴蟲的細(xì)胞膜破損與雙氫青蒿素作用于微絲有關(guān)，而人五毛滴蟲細(xì)胞膜的破損可能與硝唑尼特作用于微絲有關(guān)。本試驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特防治人五毛滴蟲病的臨床應(yīng)用提供了參考。