張麗娟，楊金先，陳 強(qiáng)，李英英，葛均青

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

牛蛙(RanacatesbianaShaw)是一種可食用的大型蛙類，原產(chǎn)于北美，1958年引進(jìn)我國，20世紀(jì)80年代中期開始規(guī)模化養(yǎng)殖[1]。牛蛙的適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖迅速、生長快，并且其肉白味美，營養(yǎng)價(jià)值高，受到了廣大消費(fèi)者的喜愛，因此養(yǎng)殖牛蛙的產(chǎn)量也年年攀高，成為我國淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一[2]。隨著規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖形式的不斷增大，牛蛙的病害問題也日益嚴(yán)重。

牛蛙的病害主要有細(xì)菌性疾病、寄生蟲病、病毒性疾病等。細(xì)菌性疾病主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)等革蘭陰性菌引起的腹水病、紅腿病，鏈球菌(Streptococcus)引起的腐皮病[3-4]，遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)引起的牛蛙愛德華菌病[5]等。細(xì)菌性疾病暴發(fā)后，及時(shí)找到病因并對癥給藥能夠在很大程度上減少損失。寄生蟲主要有體表的蚧螨、蛭、吸血蟲等[6]，體內(nèi)消化道、呼吸道的嶺南隱彎吸蟲[7]、中華擬后盤吸蟲[8]等，牛蛙的寄生蟲病可以通過改善蛙的生活環(huán)境及餌料衛(wèi)生來預(yù)防，可定期添加抗生素來驅(qū)除寄生蟲。牛蛙的病毒性疾病主要為蛙虹彩病毒病，蛙虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)會(huì)跨物種感染不同的水生動(dòng)物，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了越來越多的關(guān)注[9]。

RGV屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)，蛙病毒屬(Ranavirus)，在我國是1996年從沼澤綠牛蛙中首次分離[10]。PCV是一類胞漿型雙鏈DNA病毒，平面呈六邊形，表面為二十面體對稱結(jié)構(gòu)[11]，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，可數(shù)月存活于土壤和水體中并保持感染性[12]。RGV是一種危害牛蛙的重要病原，具有很強(qiáng)的傳染性，可造成高達(dá)90%的死亡率，宿主感染后發(fā)病快，表現(xiàn)為食欲減退、行動(dòng)遲緩，四肢發(fā)紅出血，少數(shù)腹部鼓起等特征[13]。

本研究從發(fā)病牛蛙中分離培養(yǎng)出一株病毒，經(jīng)鑒定，確定該病毒為一株RGV，稱之為RGV-FJ；攻毒試驗(yàn)表明，RGV-FJ感染后牛蛙四肢及腹部發(fā)紅出血，內(nèi)臟出血明顯，癥狀與養(yǎng)殖場中患病牛蛙相一致;通過組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)病牛蛙的皮膚、肝臟、腎臟及肺部均有病變產(chǎn)生，且在牛蛙的各組織器官中均檢測到了RGV-FJ。該病毒能引發(fā)牛蛙全身性感染，且對牛蛙的致死率高，在感染第4天的累積死亡率達(dá)到94.12%。這為進(jìn)一步開展分離病毒的致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞鯉魚表皮瘤細(xì)胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line，EPC)由本實(shí)驗(yàn)室保存，在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的Leibovitz L-15培養(yǎng)液中27℃培養(yǎng)。

1.2 病毒的細(xì)胞分離2010年10月，福建省某牛蛙養(yǎng)殖場暴發(fā)傳染性疾病，取發(fā)病牛蛙的肝臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟器官，勻漿后，取上清液過濾除菌，接種EPC細(xì)胞，每天觀察和記錄細(xì)胞病變情況，收集上清繼續(xù)接種EPC細(xì)胞進(jìn)行傳代，連續(xù)傳代3代后，細(xì)胞出現(xiàn)一致的典型病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，表明可能已分離培養(yǎng)出病毒，收集上清-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒粒子的電鏡觀察將收集的病毒培養(yǎng)上清接種到EPC細(xì)胞，待細(xì)胞病變超過50%，刮取細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，收集EPC細(xì)胞，2.5%戊二醛固定后，1% 鋨酸固定3 h，50%，70%，90%，100%酒精中梯度脫水，樹脂包埋，超薄切片，切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，在日立透射電鏡HT7700下觀察、拍照。

1.4 病毒的PCR鑒定根據(jù)蛙病毒屬代表種FV3(frog virus 3)主衣殼蛋白基因(major capsid protein，MCP)(GenBank序列號(hào)：AY548484.1)序列設(shè)計(jì)引物MCPF：5′-GAATTCATGTCTTCTGTAACTGG-3′與MCPR：5′-AAGCTTGATTGGGAATCCCATC-3′。用Pure-LinkTMDNA/RNA virus Mini Kit(生工生物工程(上海)股份有限公司)試劑盒提取分離病毒的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，抽提質(zhì)粒，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 病毒的滴度測定將病毒培養(yǎng)上清接種EPC細(xì)胞，第4天細(xì)胞病變超過80%時(shí)收集病毒培養(yǎng)物，凍融后收集上清，進(jìn)行10倍比稀釋，再接種到96孔培養(yǎng)的EPC細(xì)胞，每個(gè)稀釋度4孔，設(shè)3次重復(fù)，27℃培養(yǎng)至第5天，觀察并記錄細(xì)胞產(chǎn)生CPE的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度TCID50。

1.6 病毒的攻毒試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)牛蛙購自福建福州某牛蛙養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為75～100 g/只。將牛蛙隨機(jī)分為2組，每組20只，一組腹腔注射0.2 mL的RGV-FJ病毒(3.2×107TCID50/mL)，作為攻毒組；另一組注射0.2 mL正常EPC細(xì)胞的培養(yǎng)上清，作為對照組。攻毒后在室溫24～26℃條件下常規(guī)飼養(yǎng)，每天觀察牛蛙的健康狀況，記錄牛蛙的死亡數(shù)量及發(fā)病牛蛙的外觀癥狀。

1.7 牛蛙組織的病理學(xué)觀察分別取攻毒組和對照組牛蛙的皮膚、肝臟、脾臟、腎臟、肺組織，經(jīng)Bouin氏固定液固定后制成石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H.E)染色后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 牛蛙組織中病毒的電鏡觀察及PCR檢測取攻毒牛蛙的肺部組織，固定后按上述電鏡觀察方法觀察組織中的病毒粒子。取攻毒組牛蛙的皮膚、腸道、肺、腿部肌肉、肝臟、脾臟、腎臟組織，試劑盒提取病毒DNA，根據(jù)上述獲得的MCP序列，設(shè)計(jì)特異性引物RGV-F(5′-CAGTCGTCTCCCTCCCTACA-3′)和RGV-R(5′-AGGTGTAATTGGAGCCGA-CG-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.9 病毒的重新分離與鑒定取攻毒組牛蛙的肝臟、脾臟、腎臟及肺等組織，經(jīng)勻漿、過濾后接種EPC細(xì)胞，進(jìn)行RGV-FJ的分離培養(yǎng)，觀察和記錄細(xì)胞病變情況。取病毒感染細(xì)胞，提取病毒DNA，以RGV的特異性引物RGV-F和RGV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 牛蛙病毒的細(xì)胞分離鋪滿單層的EPC細(xì)胞接種病蛙組織勻漿液后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞從第2天開始出現(xiàn)圓縮、脫落，隨著時(shí)間延長，脫落細(xì)胞增多，到第4天有80%的細(xì)胞發(fā)生病變；隨著病變細(xì)胞增多，鋪滿培養(yǎng)瓶的單層細(xì)胞形成了網(wǎng)狀(圖1A)；而對照細(xì)胞排列緊密，貼壁嚴(yán)實(shí)，細(xì)胞形態(tài)飽滿(圖1B)。

A.感染病毒的EPC細(xì)胞；B.對照EPC細(xì)胞

2.2 病毒的電鏡觀察收集感染病毒的EPC細(xì)胞，在透射電鏡下觀察，在細(xì)胞內(nèi)觀察到呈晶格狀排列的病毒粒子，病毒粒子具囊膜，直徑約150 nm(圖2)。這與虹彩病毒粒子的特征是一致的，推測其可能是一株虹彩病毒。

圖2 病毒粒子的電鏡觀察

2.3 病毒的PCR鑒定根據(jù)蛙病毒屬代表種FV3 MCP基因設(shè)計(jì)特異性引物，提取分離病毒的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1條與預(yù)期大小一致的條帶(圖3A)。將該片段連接至pMD19-T載體后，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切驗(yàn)證(圖3B)，陽性克隆測序后獲得1條1 392 bp的核苷酸序列，序列比對分析結(jié)果顯示，該序列與多株蛙虹彩病毒的同源性超過98%。將該序列與GenBank中虹彩病毒科各屬代表種的同源序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明，該病毒株隸屬于蛙病毒屬，將其稱之為RGV-FJ。

A.MCP基因的PCR擴(kuò)增；B.pMD19-T-MCP雙酶切驗(yàn)證

圖4 基于MCP核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 病毒感染牛蛙的患病癥狀通過腹腔注射方式攻毒研究分離病毒的致病性，結(jié)果顯示，攻毒組牛蛙在第2天開始出現(xiàn)四肢及腹部發(fā)紅出血，尤其是后肢出血癥狀更為明顯，隨著時(shí)間延長，出血癥狀越來越明顯，到第4天發(fā)病牛蛙通體泛紅，顏色變深(圖5A),而對照組未見明顯發(fā)病癥狀(圖5B)。解剖后，攻毒組牛蛙的肝臟失血變白，腫脹(圖6A)，對照組牛蛙肝臟顏色鮮紅，邊緣銳利(圖6B)；攻毒組牛蛙肺部出血明顯(圖6C)，對照組未見明顯出血癥狀(圖6D)；攻毒組牛蛙的腎臟出血，顏色較深(圖6E)，對照組腎臟顏色較淺，未見明顯出血癥狀(圖6F)。

A.攻毒組牛蛙；B.對照組牛蛙

A.攻毒組肝臟；B.對照組肝臟；C.攻毒組肺；D.對照組肺；E.攻毒組腎臟；F.對照組腎臟

2.5 病毒感染牛蛙的組織病理學(xué)觀察組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，攻毒組牛蛙皮膚的黏液層細(xì)胞腫脹、排列紊亂，細(xì)胞間紅細(xì)胞浸潤，顆粒腺內(nèi)蓄積大量不規(guī)則黏液顆粒，上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性和壞死(圖7A)，而對照組皮膚黏液層細(xì)胞較平整，細(xì)胞間未見明顯紅細(xì)胞浸潤，顆粒腺內(nèi)未見不規(guī)則黏液顆粒(圖7B)。攻毒組牛蛙肝臟細(xì)胞腫脹或萎縮，空泡變性、壞死，排列紊亂；門靜脈與肝組織剝離，紅細(xì)胞滲出且腫脹成不規(guī)則形態(tài)(圖7C)；對照組肝臟細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)完整(圖7D)。攻毒組牛蛙的腎小管管腔變窄，上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，細(xì)胞界限模糊，大量紅細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(圖7E)；對照組腎臟的腎小管管腔圓滿，界限清晰(圖7F)。攻毒組牛蛙的肺部囊泡細(xì)胞排列紊亂，有大量紅細(xì)胞浸潤、淤積(圖7G)；對照組肺部的囊泡細(xì)胞排列較整齊(圖7H)；攻毒組脾臟局部細(xì)胞空泡變性(圖7I)；對照組脾臟排列緊密，結(jié)構(gòu)完整(圖7J)。

A.攻毒組皮膚；B.對照組皮膚；C.攻毒組肝臟；D.對照組肝臟；E.攻毒組腎臟；F.對照組腎臟；G.攻毒組肺；H.對照組肺；I.攻毒組脾臟；J.對照組脾臟

2.6 病毒感染牛蛙組織中病毒的電鏡觀察及PCR鑒定取攻毒組牛蛙的病變組織，切片后透射電鏡觀察，從肺部切片中發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞內(nèi)形態(tài)特征一致的單個(gè)病毒粒子，直徑大小約150 nm(圖8)。

圖8 RGV-FJ感染牛蛙肺中病毒粒子的電鏡觀察

利用PCR檢測攻毒組牛蛙各組織中的病毒感染情況，結(jié)果顯示，肝臟、脾臟、腎臟、腸道、肌肉、皮膚和肺中均檢測到RGV-FJ(圖9A)，而對照組牛蛙的相對應(yīng)組織中均未檢測到RGV-FJ(圖9B)。這表明，腹腔注射RGV-FJ引起了牛蛙全身性系統(tǒng)感染。

A.攻毒組組織；B.對照組組織。1～7.分別為肝臟、脾臟、腎臟、腸道、肌肉、皮膚和肺；8.陰性對照；9.陽性對照

2.7 RGV-FJ對牛蛙的致死作用牛蛙腹腔注射RGV-FJ后第2天出現(xiàn)發(fā)病癥狀并開始發(fā)生死亡，攻毒第4天后死亡率為94.12%，對照組牛蛙在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，存活率為100%(圖10)。

圖10 RGV-FJ感染后牛蛙的存活情況

2.8 RGV-FJ的重新分離與鑒定取攻毒組牛蛙的肝臟、脾臟、腎臟及肺等內(nèi)臟組織，勻漿后接種EPC細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示，EPC細(xì)胞出現(xiàn)了病毒感染的CPE，細(xì)胞圓縮脫落，形成漁網(wǎng)狀(圖11A)，對照組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞貼壁嚴(yán)實(shí)(圖11B)。利用RGV-FJ的特異性引物對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的單一條帶(圖12)。這表明，從腹腔注射RGV-FJ的牛蛙主要內(nèi)臟器官中重新分離出RGV-FJ。

A.感染病毒的EPC細(xì)胞；B.對照EPC細(xì)胞。

M.DL600 Marker;1.攻毒組；2.對照組

3 討論

虹彩病毒是一類可以對魚類、兩棲類、爬行類等宿主造成多器官感染，且致死率極高的病毒。該病毒呈六邊形，直徑大小為120～300 nm[14]。根據(jù)致病癥狀及宿主等差異，虹彩病毒科可分為6個(gè)屬，分別是虹彩病毒屬(Iridovirus)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、腫大虹彩病毒屬(Megalocytivirus)、蛙病毒屬(Ranavirus)[11]和十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)[15]。蛙病毒屬可感染魚類、兩棲類和爬行類，其代表株蛙病毒3型(frog virus 3，F(xiàn)V3)于1962年從蛙腫瘤勻漿中分離得到[16]。張奇亞等[17]分析了3株從牛蛙分離到的病毒RGV-9506、RGV-9807、RGV-9808，其MCP基因序列相同，且與FV3非常相似。劉曉東等[13]從牛蛙分離到一株虹彩病毒FJ049，其MCP與RGV-9808的MCP同源率達(dá)到99.8%。本研究中，我們分離的RGV-FJ與FV3的同源性超過97%，確定該病毒隸屬于蛙病毒屬。

幼蛙感染RGV后，出現(xiàn)腿部紅腫，腹部出血，肝腫大等癥狀[18]，這與本研究中患病牛蛙的體表特征及病理癥狀一致。BRAND等[19]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)V3病毒在25℃時(shí)對兩棲動(dòng)物的致病性相較于在10℃時(shí)顯著，在25℃條件下林蛙感染病毒后第4天開始死亡，而在10℃條件下感染死亡率極低。MIAUD等[20]從患病林蛙中分離到一株病毒(Common midwife toad virus,CMTV)對成年林蛙造成了100%的致死作用，林蛙的死亡是在感染后第10天開始，到第15天累積死亡率為100%。本研究中分離的RGV-FJ毒株在室溫(24～26℃)對牛蛙的致病性強(qiáng)，感染牛蛙第2天開始出現(xiàn)死亡，到第4天累計(jì)死亡率達(dá)到94.12%，這與養(yǎng)殖場中牛蛙快速暴發(fā)病癥并造成大規(guī)模死亡相一致，這可能與病毒的毒力較強(qiáng)有關(guān)，其致病機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

目前，開展的蛙虹彩病毒病研究包括虹彩病毒檢測新方法的建立[21-23]及滅活疫苗的研制[24-25]等。明確養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的致病病原是實(shí)現(xiàn)疾病有效防控的基礎(chǔ)，本研究從患病牛蛙中分離病毒，經(jīng)電鏡觀察、細(xì)胞分離培養(yǎng)及對MCP基因序列的測序并比對，確定其屬于蛙病毒屬，對該病毒進(jìn)行致病性研究，這為進(jìn)一步研究蛙虹彩病毒病的防治措施奠定基礎(chǔ)。