方劍玉，白 杰,2，席燕燕,2，黃慧敏，徐引弟，王改利,2，張青嫻，徐 彬,2，李紹鈺,2*，王克領(lǐng)*

(1．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2．畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控河南省重點實驗室，河南 鄭州 450002；3．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002)

目前發(fā)現(xiàn)與動物傳染病相關(guān)的病毒至少200多種，通過疫苗接種等措施控制了多種病毒的傳播和感染暴發(fā)，但是目前豬群仍然呈現(xiàn)多種病毒混合感染，尤其是近年來豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、非洲豬瘟病毒的出現(xiàn)和流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。其中，豬流行型腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病[1]。該病毒可感染所有年齡段的豬，特別是新生仔豬。PEDV主要感染豬小腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致明顯的腸道充血及絨毛萎縮，引起水樣腹瀉、嘔吐、厭食、脫水，發(fā)病率和死亡率較高[2]。盡管目前有商業(yè)化疫苗用于該病的預(yù)防和治療，但在我國仍頻繁引起地方性流行[3]。因此，研究和開發(fā)新型高效的抗病毒藥物已經(jīng)成為目前保證養(yǎng)豬行業(yè)健康發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

干擾素(IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。1975年，ISAACS等[4-5]首次在試驗中發(fā)現(xiàn)一種可溶性物質(zhì)，對流感病毒具有抑制增值的作用，因此將這種物質(zhì)命名為IFN。正常生理條件下，機體IFN的分泌量很低，受到病毒或者細(xì)菌等誘導(dǎo)物質(zhì)刺激時，IFN會迅速大量產(chǎn)生，成為機體第一道感染防線。由于IFN的抗病毒功能，已經(jīng)廣泛應(yīng)于人類和動物臨床多種病毒病的治療[6]。IFN根據(jù)其細(xì)胞表面受體、基因序列以及其在染色體上的定位不同，IFN國際命名委員會將IFN分為3大類：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型[7]。其中Ⅰ型IFN的抗病毒活性最強，其基因主要分布于1和10號染色體上，豬的Ⅰ型IFN包括17個IFN-α亞型，11個IFN-δ亞型，7個IFN-ω亞型和單一的IFN-β、IFN-К、IFN-ε亞型[8- 9]。IFN-α是一種分泌蛋白，這種糖蛋白在體內(nèi)由信號肽引導(dǎo)IFN-α分泌到細(xì)胞外后，信號肽被切割分解，形成成熟的IFN，多數(shù)IFN-α翻譯后均沒有進行糖基化修飾[10]。

研究證明豬的不同IFN-α亞型之間雖然氨基酸同源性較高，但其抗病毒活性差異較大，目前針對豬IFN-α14抗病毒活性報道較少。為更為詳細(xì)了解豬不同亞型IFN-α的抗病毒活性，本研究合成了豬IFN-α14的成熟肽基因，采用大腸桿菌進行表達(dá)后，進行Ni瓊脂糖凝膠柱親和層析純化，檢測了純化豬IFN-α14對PEDV的抗病毒活性。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞與質(zhì)粒含His-Tag的原核表達(dá)載體pCSMH由本實驗室保存；VERO細(xì)胞由本實驗室保存；PEDV 毒株(MK124712)由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院免疫學(xué)重點實驗室惠贈；原核表達(dá)并純化的豬IFN-α2、8蛋白由本實驗室保存。

1.2 主要試劑預(yù)染蛋白Marker、氨芐青霉素(ampicillin)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、Ni-NTA瓊脂糖凝膠、尿素、鹽酸胍購自北京索萊寶科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、XhoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa生物工程有限公司；核酸提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒、T4連接酶均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠源抗豬IFN-α多克隆抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；羊抗鼠熒光二抗(IRDye?680RD)購自美國LI-COR公司。

1.3 引物用于熒光定量PCR擴增用引物見表1，由上海生工生物工程股份有限公司進行合成。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.4 重組質(zhì)粒pCSMH-poIFN-α14的構(gòu)建豬IFN-α14基因序列(GQ415068)由DNASTAR軟件進行序列分析后，在序列兩端加入XhoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶基因序列和His標(biāo)簽后，由上海生工生物工程有限公司進行基因合成，利用XhoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶對合成的豬IFN-α14基因序列和pCSMH質(zhì)粒雙酶切后，進行瓊脂糖電泳。采用凝膠回收試劑盒進行DNA純化，將目的基因與質(zhì)粒片段在16℃連接15 min構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pCSMH-poIFN-α14。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒后進行酶切鑒定，并送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.5 重組豬IFN-α14工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化將陽性單克隆菌落接種至含氨芐的LB培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液D值為0.6～0.8。將菌液轉(zhuǎn)移至42℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，收集菌體， 6 000 r/min離心15 min，棄上清，加入PBS (pH=7.0) 洗滌菌體，重復(fù)清洗1次；按照菌體∶溶解buffer(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH=8.0)1∶10 (W/V) 將菌體懸浮混勻，加入終濃度為 1 mmol/L PMSF和0.2～0.4 g/L溶菌酶，冰上孵育20 min。將菌體用超聲破碎儀進行破碎，設(shè)置功率為5%，超聲5 s間歇5 s，超聲25 min至菌液澄清；將破碎后菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r/min、4℃離心 20 min，棄上清，用菌體裂解液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，6 mol/L guanidine hydrochloride，pH=8.0)將包涵體懸浮，采用Ni-瓊脂糖凝膠純化柱對重組豬IFN-α14蛋白進行分離純化。分段收集流出液，每1個柱體積收集1管，分別對純化后的蛋白進行檢測。

1.6 Western blot 檢測豬IFN-α14的特異性將純化后的豬干擾素-α14蛋白進行SDS-PAGE電泳，并將目的蛋白轉(zhuǎn)印NC膜，23 V電壓轉(zhuǎn)印15 min。采用鼠源抗豬IFN的抗體進行Western blot，檢測表達(dá)蛋白的特異性。

1.7 PEDV滴度測定將Vero細(xì)胞接種96孔板，待長成單層后，用無鈣、鎂離子的Hank’s (37℃預(yù)熱)稀釋洗滌2次，棄去殘留液體。取待檢PEDV樣品，用含4 mg/L胰酶的DMEM稀釋液，將病毒液進行10×倍比連續(xù)稀釋至×10-11，稀釋體系為100 μL病毒液添加900 μL稀釋液。將稀釋好的病毒液接種至96孔Vero細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度接種8個孔，100 μL/孔。放置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，培養(yǎng)3～5 d，并計算TCID50。計算公式：距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))；logTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度對數(shù)。

1.8 熒光定量PCR采用OMIGA RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用南京Vazyme公司的HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)過程如下：加入8 μL提取RNA模板(總RNA不超過500 ng)，2 μL 5 × qRT SuperMixⅡ，然后25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。合成的cDNA用南京Vazyme公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix預(yù)混酶在ABI公司7300型全自動熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)，β-actin基因作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min，擴增程序為95℃ 10 s，60℃ 30 s共40個循環(huán)，并添加溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后利用ABI 7300軟件分析數(shù)據(jù)。本研究采用2-△△Ct相對定量。計算公式：Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因=△Ct；△Ct處理樣本-△Ct對照樣本=△△Ct；倍數(shù)變化 = 2-△△Ct。

1.9 在Vero細(xì)胞上檢測重組豬IFN-α14抑制PEDV復(fù)制的活性將Vero細(xì)胞接種至24孔板，每孔2×105個細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿單層后，分別加入質(zhì)量濃度為0.1，1.0，10.0 μg/L重組IFN處理Vero細(xì)胞，同時設(shè)置未處理對照組。24 h后接種103TCID50的PEDV，感染48 h后收集細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，采用HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)進行反轉(zhuǎn)錄，用SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)PEDV水平，同時收集細(xì)胞上清，并檢測其TCID50。

1.10 豬IFN-α14抑制細(xì)胞增殖試驗用CellTiter96@AQueous one solution cell proliferation assay(Promega生物公司)檢測重組豬IFN-α14對Vero的細(xì)胞毒性。將Vero細(xì)胞鋪96孔板，待長成單層后，取10 μg/L重組豬IFN-α14加入Vero細(xì)胞單層后24 h，加入20 μL的Cell Titer 96?Aqueous 單溶液試劑并直接加入到96細(xì)胞板培養(yǎng)孔中，孵育1～4 h，然后在96 孔板讀板儀上記錄D490 nm值。D490 nm值與培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量直接成正比。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pCMSH-poIFN-α14的鑒定將豬IFN-α14基因去掉信號肽序列，加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點和his標(biāo)簽序列后，進行密碼子優(yōu)化，送上海生工生物有限公司進行基因合成。將合成目的片段和pCMSH質(zhì)粒分別采用BamHⅠ和XhoⅠ酶切、連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒采用BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定后，進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在3 800，545 bp位置可觀察到目的特異性條帶(圖1)，與目的片段大小相符。并對目的片段進行測序分析，結(jié)果證明pCMSH-poIFN-α14重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA Marker；1.重組pCSMH-poIFN-α14質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組豬IFN-α14蛋白的大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)將包含pCMSH-poIFN-α14重組質(zhì)粒的菌液接種液體LB培養(yǎng)基，在37℃振蕩培養(yǎng)至菌液D值達(dá)0.6～0.8后，將溫度提升至42℃進行誘導(dǎo)表達(dá)，進行SDS-PAGE電泳鑒定，在19.1 kDa位置可見目的條帶，與預(yù)期大小一致，表達(dá)蛋白以包涵體形式存在(圖2)。

M.蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)對照；2.重組豬IFN-α14蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

2.3 重組豬IFN-α14蛋白的純化將表達(dá)后蛋白采用Ni+瓊脂糖凝膠進行親和層析純化復(fù)性后，采用SDS-PAGE電泳進行鑒定，結(jié)果顯示純化后蛋白純度可達(dá)到90%以上(圖3)。

M.蛋白Marker；1.純化蛋白豬IFN-α14

2.4 Western blot試驗檢測豬IFN-α14將大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白豬IFN-α14進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印NC膜，采用鼠源抗豬IFN-α亞型的特異性抗體進行Western blot試驗，在預(yù)期的位置出現(xiàn)目的條帶，未見空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌出現(xiàn)特異性條帶，證明本研究所表達(dá)重組豬IFN-α14反應(yīng)原性較好(圖4)。

2.5 豬IFN-α14蛋白在Vero細(xì)胞上對PEDV的抑制作用將Vero細(xì)胞鋪24孔板后，分別用100，10，1 μg/L的IFN-α14處理Vero細(xì)胞，24 h 后接種1 000 TCID50PEDV。感染后48 h收集細(xì)胞，采用熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)PEDV的RNA水平，結(jié)果顯示10 μg/L IFN-α14可顯著抑制PEDV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。同時，收集細(xì)胞上清，檢測細(xì)胞上清中PEDV的TCID50。結(jié)果顯示，1 μg/L的IFN-α14處理細(xì)胞，病毒核酸拷貝數(shù)和TCID50被顯著抑制，隨著IFN-α14質(zhì)量濃度的提升，10 μg/L的抑制作用極為顯著，而100 μg/L的抑制作用與10 μg/L的相當(dāng)。表明10 μg/L的重組豬IFN-α14能顯著抑制PEDV的復(fù)制(圖5A，B)，且抗病毒效果優(yōu)于poIFN-α2、8(圖5C、D)。

1.重組豬IFN-α14蛋白；2.陰性對照

*表示與對照組相比差異較顯著(P<0.05),**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01),***表示與對照組相比差異極顯著(P<0.001)

2.6 豬IFN-α14抑制細(xì)胞增殖試驗重組豬IFN-α14處理鋪滿96孔板的Vero細(xì)胞24 h后，加入20 μL 的Cell Titer 96?Aqueous 單溶液試劑，孵育1～4 h，然后在讀板儀上記錄D490 nm值。結(jié)果顯示，10 μg/L豬IFN-α14處理的細(xì)胞和空白對照細(xì)胞吸光值無明顯差異，表明重組豬IFN-α14對Vero細(xì)胞的增殖無明顯的影響(圖6)。

圖6 豬IFN-α14對Vero細(xì)胞增殖的影響

3 討論

豬Ⅰ型IFN最初因其抗病毒活性被發(fā)現(xiàn)后[11]，逐漸證明其具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性等功能。其中，豬的IFN-α和IFN-β亞型IFN抗病毒活性最強[9]。當(dāng)前，Ⅰ型IFN已經(jīng)在人和豬臨床上廣泛用于病毒性疾病的治療，例如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency,HIV)、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)等[12-15]。盡管如此，由于副作用較大，活性不高、半衰期短等問題，限制了IFN制劑在臨床上的應(yīng)用。因此，開發(fā)高效低毒的IFN抗病毒制劑對當(dāng)前臨床疫病的防治具有重要意義。

當(dāng)前IFN產(chǎn)品雖然具有一定的抗病毒效果，但在臨床上還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有滿足對各種病毒性疾病預(yù)防和治療的要求。多個專家學(xué)者采用各種蛋白突變和改構(gòu)等方法來提高IFN的抗病毒活性，降低其毒副作用。研究報道對人IFN-α進行蛋白質(zhì)改構(gòu)后，獲得新型IFN制劑“樂復(fù)能”目前已廣泛應(yīng)用于HBV的臨床治療，且中國疾控中心病毒研究所證明“樂復(fù)能”對新冠病毒感染復(fù)制具有顯著的抑制作用[16-17]。HUANG等[18-19]也先后嘗試對豬IFN-α的氨基酸進行突變以提高IFN的抗病毒活性，研究證明氨基酸突變在一定程度可有效提高IFN的抗病毒活性。研究證明豬的IFN-α亞型抗病毒活性最強，且豬不同IFN-α亞型誘導(dǎo)機體抗病毒反應(yīng)的能力差異較大[20-21]。本研究克隆并表達(dá)了重組豬IFN-α14蛋白，結(jié)果證10 μg/L的IFN-α14能有效抑制PEDV的復(fù)制，并與前期本實驗室表達(dá)的豬重組IFN-α2、8相比，抗病毒效果更佳，該差異可能源于IFN與受體蛋白親和力的差異。通過研究比較多種亞型IFN-α的抗病毒效果，為更好的改構(gòu)IFN并提高其抗病毒效果具有重要意義。

有研究學(xué)者采用真核表達(dá)、原核表達(dá)等多種表達(dá)系統(tǒng)對豬的IFN進行表達(dá)，結(jié)果證明大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)時間短、成低廉、易于純化等多種有點。目前多種IFN產(chǎn)品主要是采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進行表達(dá)。本研究采用溫度誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)豬IFN-α14蛋白，相比較化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵過程中需要增加誘導(dǎo)劑的情況，溫度誘導(dǎo)可進一步降低成本，且更方便于大規(guī)模生產(chǎn)。采用親和層析方法純化后，蛋白純度可達(dá)到90%以上。