薛艷麗，婁朝晅，薛小琦，田廣林

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，洛陽 471000；2.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，洛陽 471000；3.遂成藥業(yè)股份有限公司，新鄭 451100)

乳核散結(jié)片收載于《中華人民共和國藥典》2020年版一部，由當(dāng)歸、淫羊藿、郁金、柴胡、漏蘆等10味中藥組方而成，具有疏肝活血、祛痰軟堅功效，臨床主要用于肝郁氣滯、痰瘀互結(jié)所致數(shù)量不同、大小不一、質(zhì)軟或中等硬的乳房腫塊或結(jié)節(jié)，或乳房脹痛、經(jīng)前疼痛加劇的乳腺增生病[1-3]。

乳核散結(jié)片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]僅對佐藥淫羊藿中一種成分進(jìn)行定量研究，未對方中君藥和臣藥所含成分進(jìn)行研究分析，筆者也未檢索到與本品質(zhì)量分析相關(guān)的文獻(xiàn)報道。筆者參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物研究方法，從整體上把握中藥指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜一測多評[5-6](high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLC-QAMS)法對乳核散結(jié)片方中君藥郁金所含活性成分雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素，臣藥當(dāng)歸所含活性成分洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當(dāng)歸內(nèi)酯A，佐藥淫羊藿所含主要活性成分淫羊藿苷和寶藿苷I含量進(jìn)行同時測定，以期為全面研究和評價乳核散結(jié)片質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(安捷倫公司，Agilent 1200型；島津公司，LC-20AT型)；液相色譜柱(Agilent TC-C18柱、Diamonsil C18柱和Hypersil gold C18柱，規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm)；XS105DU型電子分析天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 乳核散結(jié)片(廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每片0.36 g，批號：S00015、S00023、S00024)；色譜級乙腈，其余試劑均為分析純；淫羊藿苷、寶藿苷I、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110737-201516，111852-201603，112004-201501，112003-201501，110766-201721，含量分別為94.2%、99.9%、95.0%、98.5%、98.7%)；洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯和藁本內(nèi)酯A對照品(上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號分別為15102222，17092822，17112023，17111023，含量分別為98.5%，99.6%，94.4%和98.1%)；歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對照品(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：PRF10021443，含量：97.7%)。

2 方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，70%甲醇溶解，制成各對照品濃度分別為0.198，0.112，5.764，4.156，0.638，4.952，2.734，0.798，1.072和1.986 mg·mL-1混合對照品貯備液；精密吸取混合對照品貯備液1.0 mL，70%甲醇定容至20 mL，制成各對照品濃度分別為9.9，5.6，288.2，207.8，31.9，247.6，136.7，39.9，53.6和99.3 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備 取除去薄膜衣的乳核散結(jié)片20片，研細(xì)，取細(xì)粉2 g，精密稱定，置25 mL量瓶，加70%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷經(jīng)70%甲醇定容，搖勻得乳核散結(jié)片供試品溶液。按乳核散結(jié)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中工藝處方制備無當(dāng)歸、無淫羊藿和無郁金陰性供試品，再按上述方法制成各陰性供試品溶液。

2.3色譜條件及專屬性實驗 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；流動相乙腈-0.6%醋酸溶液，梯度洗脫(0～11.0 min，19.0%乙腈；11.0～24.0 min，19.0%→38.0%乙腈；24.0～32.0 min，38.0%→50.0%乙腈；32.0～48.0 min，50.0%→60.0%乙腈；48.0～60.0 min，60.0%→19.0%乙腈)，流速1.0 mL·min-1；檢測波長為280 nm(0～32.0 min檢測洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、淫羊藿苷和寶藿苷I)[7-14]和420 nm(32.0～60.0 min檢測雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素)[15-18]；進(jìn)樣量10 μL。依法進(jìn)樣“2.1—2.2”項各溶液檢測(圖1)，洋川芎內(nèi)酯I等10種成分峰形對稱，理論板數(shù)按各成分色譜峰計均≥5500，且與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，陰性供試品對乳核散結(jié)片中10種成分測定未產(chǎn)生干擾。

1.洋川芎內(nèi)酯I；2.洋川芎內(nèi)酯H；3.阿魏酸松柏酯；4.藁本內(nèi)酯；5.歐當(dāng)歸內(nèi)酯A；6.淫羊藿苷；7.寶藿苷I；8.雙去甲氧基姜黃素；9.去甲氧基姜黃素；10.姜黃素；a.混合對照品溶液；b.乳核散結(jié)片樣品溶液；c.當(dāng)歸陰性樣品溶液；d.淫羊藿陰性樣品溶液；e.郁金陰性樣品溶液。

2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項混合對照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 mL，分別以70%甲醇定容至20 mL，得6個混合對照品溶液，依法測定，以洋川芎內(nèi)酯I等10種成分濃度對峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得10種成分回歸方程(表1)。

表1 乳核散結(jié)片中各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與相關(guān)系數(shù)

2.5精密度實驗 連續(xù)進(jìn)樣“2.1”項下對照品溶液6次，得洋川芎內(nèi)酯I等10種成分峰面積RSD分別為1.03%，1.19%，0.52%，0.67%，0.98%，0.59%，0.74%，0.86%，0.72%和0.61%。

2.6重復(fù)性實驗 將同一批乳核散結(jié)片按“2.2”項方法制備供試品溶液6份，依法進(jìn)樣得洋川芎內(nèi)酯I等10種成分含量RSD分別為0.81%，1.34%，1.40%，1.72%，0.96%，1.58%，1.34%，1.40%，1.72%和1.63%。

2.7乳核散結(jié)片供試品溶液穩(wěn)定性考察 取乳核散結(jié)片供試品溶液1份，于制備后0，2，4，6，12和24 h進(jìn)樣檢測，得洋川芎內(nèi)酯I等10種成分峰面積的RSD分別為1.33%，0.91%，0.99%，1.25%，0.57%，1.08%，0.91%，0.99%，1.25%，0.95%，表示乳核散結(jié)片供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率實驗 取已知洋川芎內(nèi)酯I等10種成分含量的乳核散結(jié)片(批號：S00015)，除去薄膜衣后研細(xì)，取9份，每份1 g，精密稱定，置25 mL量瓶，分別精密加入加標(biāo)對照品溶液(洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、淫羊藿苷、寶藿苷I、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素對照品濃度分別為0.154，0.078，4.582，3.192，0.462，3.854，2.138，0.612，0.794和1.512 mg·mL-1)0.8，1.0和1.2 mL，各平行3份，再按“2.2”項方法制備加樣供試品溶液。依法分析檢測，得洋川芎內(nèi)酯I等10種成分平均加樣回收率及RSD分別為97.85%(0.82%)，96.97%(1.03%)，100.07%(0.62%)，99.42%(1.34%)，98.64%(0.80%)，99.43%(1.13%)，100.02%(0.67%)，98.35%(0.97%)，98.70%(1.23%)和97.99%(1.65%)。

2.9相對校正因子的測定及耐用性考察

2.9.1相對校正因子的測定 依法進(jìn)樣“2.4”項6個混合對照品溶液，檢測洋川芎內(nèi)酯I等10種成分的峰面積，以淫羊藿苷為內(nèi)參物，按照相對校正因子計算公式：k/s=k/s=(Xk×Ys)/(Xs×Yk)(式中X為質(zhì)量濃度，Y為峰面積，s為其他成分，k為內(nèi)參物)計算其他9種成分相對校正因子(表2)。

表2 各成分相對校正因子

2.9.2儀器和色譜柱對相對校正因子的影響 依法進(jìn)樣“2.1”項下對照品溶液，考察Agilent 1200型和LC-20AT型高效液相色譜儀及Agilent TC-C18柱、Diamonsil C18柱和Hypersil gold C18柱條件下測得的相對校正因子(表3)。

表3 不同儀器和色譜柱測得的相對校正因子

2.9.3柱溫對相對校正因子的影響 依法進(jìn)樣“2.1”項下對照品溶液，考察不同柱溫下測得的相對校正因子(表4)。

表4 不同柱溫下測得的相對校正因子

2.9.4流速對相對校正因子的影響 依法進(jìn)樣“2.1”項下對照品溶液，考察不同流速條件下測得的相對校正因子(表5)。

表5 不同流速下測得的相對校正因子

2.10色譜峰的定位 依法進(jìn)樣“2.1”項對照品溶液，檢測，記錄各成分保留時間，采用相對保留時間值法對洋川芎內(nèi)酯I等10種成分進(jìn)行色譜峰定位，考察高效液相色譜儀和液相色譜柱對相對保留時間值的影響(表6)。

表6 不同儀器和色譜柱條件下待測成分色譜峰相對保留時間值

2.11兩種方法測定結(jié)果比較 取乳核散結(jié)片3批，制備乳核散結(jié)片供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，先用外標(biāo)法計算10種成分含量，再用“2.9.1”項相對校正因子值計算其他9種成分含量(表7)。結(jié)果一測多評法計算值與外標(biāo)法結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(RAD<2.0%)。

表7 乳核散結(jié)片各成分含量測定結(jié)果

3 討論

3.1流動相的選擇 乳核散結(jié)片為復(fù)方制劑，方中成分多且雜，本實驗在選擇流動相時，首先對比甲醇-水和乙腈-水兩個基礎(chǔ)流動相對基線平穩(wěn)性及各成分分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水流動相體系檢測時，基線嚴(yán)重漂移，個別成分無法準(zhǔn)確積分；乙腈-水流動相體系則基線水平，不足之處是阿魏酸松柏酯A、淫羊藿苷色譜峰出現(xiàn)拖尾，與相鄰峰分離不完全，且峰對稱度不符合要求。對乙腈-甲酸溶液[7-9，15]、乙腈-醋酸溶液[10，16-18]進(jìn)行對比，又經(jīng)過摸索酸溶液濃度，最終確定流動相為乙腈-0.6%醋酸溶液[18]進(jìn)行梯度洗脫，乳核散結(jié)片中洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯、淫羊藿苷、寶藿苷I、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素與相鄰色譜峰均能有效分離，色譜峰峰形尖銳，對稱性好。

3.2供試品溶液制備方法的確定 本實驗在確定制備供試品溶液方法時，以乳核散結(jié)片中洋川芎內(nèi)酯I等10種成分的提取效果為首選指標(biāo)，同時考慮雜質(zhì)干擾因素，以水[7]、70%甲醇[8]、甲醇[9]和稀乙醇[11-12]為溶劑，采用超聲提取[7-13，16-17，19]和加熱回流提取[18]兩種提取方式，提取時間20，30，40和60 min時制得的溶液進(jìn)樣檢測，最終優(yōu)選確定供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲提取30 min。

HPLC因檢測自動化、靈敏、應(yīng)用范圍廣、檢測快速、效率高、供試品制法簡便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于各種藥物及其制劑的分析研究，筆者在本實驗采用HPLC-QAMS法對乳核散結(jié)片中10種成分進(jìn)行含量同步測定，實驗進(jìn)行了含量方法學(xué)驗證及校正因子耐用性考察，對比兩種方法含量測定結(jié)果，方法易操作，靈敏、準(zhǔn)確、可靠，可以指導(dǎo)制藥企業(yè)在生產(chǎn)過程中優(yōu)化質(zhì)控參數(shù)，為全面評價乳核散結(jié)片產(chǎn)品質(zhì)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量均一安全提供實驗依據(jù)。