袁方玉，盛嬋娟，鞠程，李方園，臧彩霞，尚俊美，劉慧，鮑秀琦，張丹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的神經(jīng)退行性疾病。其主要病理特征為中腦多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡及細(xì)胞內(nèi)路易小體形成，最終導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退，從而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙。其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩。流行病學(xué)調(diào)查顯示，世界范圍內(nèi)65歲以上人群該病發(fā)病率約1%，80歲以上人群發(fā)病率3%，該病嚴(yán)重影響老年人身體健康和生活質(zhì)量[1]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡可能在PD發(fā)生和發(fā)病進(jìn)程中起作用，炎癥調(diào)節(jié)因子可能促進(jìn)α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)錯(cuò)誤折疊和聚集，并造成α-Syn擴(kuò)散[2]。PD患者及PD動(dòng)物模型中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[3-4]、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)[5]等炎癥因子表達(dá)增加，表明炎癥在PD發(fā)病中起關(guān)鍵作用，因此針對(duì)炎癥可能具有治療或延緩PD發(fā)病的作用[6]。此外，PD發(fā)病過(guò)程中還涉及多種細(xì)胞死亡途徑[7]，其中細(xì)胞凋亡尤為重要。研究表明，B淋巴細(xì)胞瘤-2(B lymphoblastoma-2，Bcl-2)可保護(hù)腦組織免受有毒物質(zhì)損傷，過(guò)表達(dá)Bcl-2的多巴胺能神經(jīng)元纖維更長(zhǎng)，表明Bcl-2具有促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育作用，但Bcl-2異常表達(dá)可能導(dǎo)致PD發(fā)生和發(fā)展[8]。

GJ-4是從中藥梔子中提取的富含藏紅花色素類活性成分的物質(zhì)[9-10]，此前有學(xué)者采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(high-performance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD)于波長(zhǎng)440 nm對(duì)GJ-4進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)GJ-4中主要成分為藏紅花酸二葡糖基酯(dicrocin)和藏紅花素(crocin)[11-12]。前期研究表明，GJ-4可顯著抑制AD小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[13]，GJ-4是否對(duì)PD有神經(jīng)保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-metyl-4-fenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridin，MPTP)致小鼠亞急性PD模型觀察GJ-4對(duì)PD的治療作用，并初步探索其作用機(jī)制[8]。

1 材料與方法

1.1試劑 MPTP[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：SLBZ7928]，GJ-4(暨南大學(xué)姚新生院士課題組提供)，左旋多巴(levodopa，L-Dopa，上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：SH2912)，放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、BCA(bicinchoninic acid assay)蛋白定量試劑盒(上海生工生物科技有限公司，批號(hào)分別為G707DA0012、G911DB0003)，蛋白磷酸酶抑制劑(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200819)，蛋白酶抑制劑(陶素生化科技有限公司，批號(hào)：C001)，10%免封閉聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝膠快速制備試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：P8010690)，兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，批號(hào)分別為0030420101，9100026001，9300014001)，兔抗iNOS多克隆抗體(cell signaling technology，CST，批號(hào)：5)，Transzol up plus RNA kit提取試劑盒、Reverse Transcriptase試劑盒、Super Mix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為N30289、O10306、N30821)，羧甲基纖維素鈉[sodium carboxymethyl cellulose salt，CMC-Na，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：SLBW8428]，0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，批號(hào)：2106152003)，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G0002)，水合氯醛、蔗糖、多聚甲醛[福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為20190509，20190122，20190910]，5×上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20190718)，脫脂奶粉(蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)：70120200)，聚偏乙烯氟化物膜[polyvinylidene fluoride，PVDF，密理博(Millipore)公司，批號(hào)：R0HB74436]。

1.2儀器 小鼠轉(zhuǎn)棍儀(意大利Ugo Basile公司)，爬桿棒(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，DYY-6C型垂直電泳儀和電轉(zhuǎn)儀系統(tǒng)(北京六一儀器廠)，Eclipse 80i正置顯微鏡(日本Nikon公司)，LAS4000生物分子成像儀(美國(guó)GE公司)，7900HT96快速實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國(guó)ABI公司)，SIGMA 3-18K型冷凍高速離心機(jī)[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57/BL6J小鼠，雄性，體質(zhì)量22～25 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0023。小鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，于室溫24～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%、明暗各12 h交替的藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范(good laboratory practice，GLP)動(dòng)物房飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中所有操作均遵循北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.4小鼠分組及模型制備與給藥 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，采用轉(zhuǎn)棍法剔除運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)小鼠，將剩余小鼠采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分配至空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、GJ-4 25 mg·kg-1組、GJ-4 50 mg·kg-1組、GJ-4 100 mg·kg-1組[14]、陽(yáng)性對(duì)照組(L-Dopa組，20 mg·kg-1)，每組15只。以0.5%CMC-Na將GJ-4配制為濃度分別為2.5，5，10 mg· mL-1的溶液；以0.5% CMC-Na配制2 mg· mL-1L-Dopa溶液。GJ-4各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)劑量GJ-4與L-Dopa，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃給予相同劑量0.5% CMC-Na。給藥后30 min，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和GJ-4各劑量組腹腔注射3 mg·mL-1MPTP，每天1次，連續(xù)7 d。停止注射MPTP后繼續(xù)給藥，每天1次，連續(xù)5 d。實(shí)驗(yàn)第7天和第12天進(jìn)行轉(zhuǎn)棍實(shí)驗(yàn)和爬桿測(cè)試，第13天將小鼠斷頭取腦，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力測(cè)試

1.5.1爬桿實(shí)驗(yàn) 將一直徑25 cm軟木球固定于一根長(zhǎng)50 cm、粗1 cm木桿頂端，木桿纏上紗布以防打滑，將被測(cè)小鼠放至小球上，觀察小鼠從球上下來(lái)的表現(xiàn)，給出不同評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，5分：四肢并用，一步一步協(xié)調(diào)向下爬行；4分：一步一步向下爬行但兼有后肢滑行行為；3分：爬過(guò)一半距離后向下滑行，但可抱緊桿；2分：未爬過(guò)一半距離即出現(xiàn)滑行行為；1分：爬過(guò)一半距離后無(wú)法抓桿從桿上掉落；0分：未爬過(guò)一半距離即無(wú)法抓桿，從桿上掉落。每只小鼠測(cè)試2次，按照上述標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，取平均值。

1.5.2轉(zhuǎn)棍實(shí)驗(yàn) 各組小鼠在造模前接受3次轉(zhuǎn)棍訓(xùn)練。經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后，小鼠在棍上的表現(xiàn)達(dá)到穩(wěn)定水平。轉(zhuǎn)棍為直徑4 cm、長(zhǎng)60 cm、用隔板平均分為5段的水平桿，保證動(dòng)物彼此不受影響。轉(zhuǎn)速設(shè)置為30 r·min-1。將小鼠置于桿上，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，最長(zhǎng)時(shí)限設(shè)置為120 s，記錄從開(kāi)始到小鼠掉落時(shí)間，記為潛伏期(即第一次從桿上掉落的時(shí)間)，根據(jù)小鼠在轉(zhuǎn)棍上停留時(shí)間評(píng)價(jià)GJ-4對(duì)PD模型運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力影響的改善作用。

1.6免疫組化實(shí)驗(yàn) 末次行為學(xué)測(cè)試后，每組隨機(jī)(對(duì)動(dòng)物編號(hào)，通過(guò)抽選隨機(jī)數(shù)的方法抽取)選取小鼠3只，以4%水合氯醛麻醉，0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行心臟灌流，持續(xù)10～15 min至肝臟完全變白，換用3%蔗糖4%多聚甲醛PBS溶液繼續(xù)灌注15～20 min，待小鼠肝臟變硬、肢體僵硬即完成固定。灌流小鼠斷頭取腦，腦組織脫水固定。將小鼠腦組織固定在冷凍切片機(jī)進(jìn)行恒冷切片，片厚40 μm，收集中腦部位腦片進(jìn)行TH免疫組化染色。每組小鼠3只，每只小鼠選取相同部位腦片8張，共得腦片24張，正置顯微鏡觀察黑質(zhì)區(qū)域，計(jì)數(shù)小鼠黑質(zhì)部位陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目，由與本實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)人員計(jì)數(shù)。

1.7Western blotting實(shí)驗(yàn) 取小鼠中腦，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑充分勻漿，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min(r=82.0 mm)，吸取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白樣品的濃度測(cè)定，用上樣緩沖液將蛋白濃度調(diào)整一致，混勻煮沸使蛋白變性。用10%PAGE(10%免封閉PAGE凝膠快速制備試劑盒)凝膠電泳分離蛋白，蛋白上樣量40 μg。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u動(dòng)封閉2 h，4 ℃分別與兔抗TH多克隆抗體(1：500)、兔抗iNOS多克隆抗體(1：500)和兔抗β-actin單克隆抗體(1：1000)共孵育過(guò)夜。洗膜3次，再與相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(ABclonal)共孵育2 h。使用LAS 4000(美國(guó)GE公司)進(jìn)行ECL化學(xué)顯色。Gel Pro分析條帶灰度，目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn) 按照Transzol up plus RNA kit提取試劑盒、Reverse Transcriptase試劑盒操作說(shuō)明提取小鼠中腦RNA和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Super Mix試劑盒在Applied Biosystems PRISM 7900 PCR儀上將上述樣品分別用TNF-α、IL-1β、Bax和Bcl-2引物擴(kuò)增，各基因引物由上海生工生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增步驟如下：95 ℃3 min，1 ℃3 min進(jìn)行預(yù)變性；95 ℃變性30 s。60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。所有樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算每個(gè)目標(biāo)基因/管家基因β-actin相對(duì)量。

表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1GJ-4對(duì)亞急性PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)能力的改善作用 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠爬桿評(píng)分明顯降低(P<0.01)，提示模型小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙；與模型對(duì)照組比較，GJ-4 50 mg·kg-1組和GJ-4 100 mg·kg-1組小鼠爬桿評(píng)分顯著提高(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠爬桿評(píng)分顯著提高(P<0.05)(圖1A)。

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠在轉(zhuǎn)棍上停留時(shí)間顯著縮短(P<0.01)，提示其出現(xiàn)行為學(xué)障礙；與模型對(duì)照組比較，GJ-4 50 mg·kg-1組與GJ-4 100 mg·kg-1組小鼠在轉(zhuǎn)棍上停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在轉(zhuǎn)棍上停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)(圖1B)。結(jié)果表明，GJ-4對(duì)PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)障礙具有改善作用。

A.爬桿實(shí)驗(yàn)(n=10～14)；B.轉(zhuǎn)棍實(shí)驗(yàn)(n=10～14)；①與空白對(duì)照組比較，t=3.119～3.480，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=2.130～3.002，P<0.05。

2.2GJ-4對(duì)亞急性PD模型小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與中腦TH蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2?？瞻讓?duì)照組小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元染色深；模型對(duì)照組染色較淺，分布稀疏，TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較空白對(duì)照組明顯減少(P<0.01)；而與模型對(duì)照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元染色較深，TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加(P<0.01)。

Western blot檢測(cè)小鼠中腦TH蛋白表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2B。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TH蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組TH蛋白表達(dá)呈現(xiàn)顯著升高(P<0.01)。

A.免疫組化檢測(cè)小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元(n=3，×200)；B.Western blot檢測(cè)小鼠中腦TH蛋白表達(dá)(n=5)；①與空白對(duì)照組比較，t=3.671～5.020，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=4.609～5.189，P<0.01。

2.3GJ-4抑制亞急性PD模型小鼠中腦炎癥因子表達(dá)情況 結(jié)果見(jiàn)圖3。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組iNOS蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組iNOS表達(dá)顯著下降(P<0.05)。

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TNF-α與IL-β mRNA表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組上述兩種炎癥因子mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

A.Western blot檢測(cè)小鼠中腦 iNOS表達(dá)(n=5)；B.qPCR檢測(cè)小鼠中腦TNF-α mRNA表達(dá)(n=4)；C.qPCR檢測(cè)小鼠中腦IL-1β mRNA表達(dá)(n=4)；①與空白對(duì)照組比較，t=2.309～2.956，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=2.427～2.877，P<0.05。

2.4小鼠中腦神經(jīng)元凋亡情況 結(jié)果見(jiàn)圖4。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組中腦Bax mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組中腦Bax mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

A.Bax mRNA表達(dá)結(jié)果(n=3)；B.Bcl-2 mRNA表達(dá)結(jié)果(n=5)；①與空白對(duì)照組比較，t=3.513～6.647，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=2.594～2.658，P<0.05。

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組中腦Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組中腦Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。提示GJ-4有抑制模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元凋亡作用。

3 討論

PD是一種常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病，目前臨床治療藥物主要有復(fù)方左旋多巴、單胺氧化酶-B抑制劑、多巴胺受體激動(dòng)劑等，這些藥物雖然可在一定程度上改善癥狀，但不能根治PD，且長(zhǎng)期用藥存在明顯不良反應(yīng)[15]。

神經(jīng)保護(hù)藥物可在PD前驅(qū)期發(fā)揮一定作用[16]。GJ-4是中藥梔子提取物，主要活性成分為藏紅花色素，具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等作用[13]。本實(shí)驗(yàn)選用目前最常用的神經(jīng)毒素MPTP損傷建立小鼠PD模型，MPTP可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷，影響運(yùn)動(dòng)功能，因此利用爬桿和轉(zhuǎn)棍實(shí)驗(yàn)測(cè)試小鼠運(yùn)動(dòng)能力，同時(shí)通過(guò)免疫組化及Western blot檢測(cè)小鼠中腦TH表達(dá)情況，共同反映腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元丟失情況及多巴胺能神經(jīng)元功能變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MPTP可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯運(yùn)動(dòng)障礙，大劑量GJ-4可顯著改善模型小鼠運(yùn)動(dòng)障礙，并能劑量依賴性提高小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量。

炎癥和細(xì)胞凋亡被認(rèn)為在PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。iNOS[4]、IL-1β、TNF-α等炎癥因子可以通過(guò)持續(xù)性炎癥反應(yīng)促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元損傷，加劇PD發(fā)病進(jìn)程[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型中，TNF-α分泌增加，并影響DA神經(jīng)元存活[18]。

KOUCHAKI等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PD患者血清TNF-α水平升高，推測(cè)其為重要的PD預(yù)后生物標(biāo)志物。而在6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型[19]和魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠模型[20]，抑制IL-1β等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)可減輕紋狀體神經(jīng)炎癥以及黑質(zhì)神經(jīng)元缺失。筆者在本研究中檢測(cè)上述炎癥因子，發(fā)現(xiàn)GJ-4 100 mg·kg-1能抑制小鼠中腦iNOS蛋白水平表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄水平抑制TNF-α、IL-1β表達(dá)，表明GJ-4具有抗炎作用。炎癥和凋亡密切相關(guān)，PD主要表現(xiàn)是多巴胺能神經(jīng)元凋亡。Bcl-2是細(xì)胞凋亡蛋白家族中重要的調(diào)控蛋白，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GJ-4 100 mg·kg-1可在轉(zhuǎn)錄水平抑制中腦Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，從而減少中腦細(xì)胞凋亡，起到緩解PD發(fā)病進(jìn)程作用。

綜上所述，GJ-4可明顯改善PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和多巴胺能神經(jīng)元功能。初步機(jī)制研究表明，GJ-4對(duì)PD的治療作用可能通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥和多巴胺能神經(jīng)元凋亡實(shí)現(xiàn)。以上研究提示，GJ-4有較好的神經(jīng)保護(hù)活性，具有開(kāi)發(fā)成為治療PD新藥的良好前景。