林鶯 張榮東 陳琦 陳仁利

寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院血液科，寧德 352100

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種獲得性造血干細(xì)胞基因突變的克隆性疾病，現(xiàn)認(rèn)為其發(fā)病主要為PIG-A基因突變［1］，但單純的PIG-A基因突變并不能解釋其異?？寺楹文軘U(kuò)增并占據(jù)優(yōu)勢。文獻(xiàn)報(bào)道，免疫因素和PNH 的發(fā)病及治療效果有關(guān)，PNH 存在T 細(xì)胞免疫功能的亢進(jìn)，該異常使造血干細(xì)胞易受到免疫系統(tǒng)攻擊，而PNH 克隆能逃避該免疫攻擊而獲得生存優(yōu)勢［2-4］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是CD4+T 細(xì)胞，在體內(nèi)能抑制免疫反應(yīng)，有關(guān)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在PNH 發(fā)病中的作用尚不清楚，且文獻(xiàn)報(bào)道鮮見，故為探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在PNH 異?？寺≈锌赡艿拿庖邫C(jī)制，本研究測定了PNH 患者T 細(xì)胞抑制性調(diào)節(jié)的變化，以此探討PNH 患者體內(nèi)異?？寺∈欠裼姓{(diào)節(jié)性T細(xì)胞的參與以及PNH 克隆擴(kuò)增優(yōu)勢的可能免疫因素。

資料與方法

1、一般資料

2018 年1 月至2022 年1 月在寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院住院或門診就診的31例PNH 患者為病例組，其中發(fā)作性PNH 患者15 例、再生障礙性貧血-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（aplastic anemia-paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，AA-PNH）患者 16 例。31 例患者中男 21 例、女 10 例，年齡20～69 歲、中位年齡 37 歲；其中發(fā)作性 PNH 組男 10 例、女5 例，年齡 23～69 歲、中位年齡 35 歲，PNH 克隆值 20%～66%、中位PNH 克隆值48%，血常規(guī)示白細(xì)胞計(jì)數(shù)1.33～6.56 ×109/L、中位白細(xì)胞計(jì)數(shù) 2.68 ×109/L，血紅蛋白56～99 g/L、中位血紅蛋白73 g/L，血小板計(jì)數(shù)12～48×109/L、中位血小板計(jì)數(shù) 21 ×109/L；AA-PNH 組男 11 例、女 5 例，年齡20～68 歲、中位年齡39 歲，PNH 克隆值19%～59%、中位PNH 克隆值42%，血常規(guī)示白細(xì)胞計(jì)數(shù)1.01～5.76 ×109/L、白細(xì)胞計(jì)數(shù)2.75×109/L，血紅蛋白57～105 g/L、中位血紅蛋白72 g/L，血小板計(jì)數(shù)13～51 ×109/L、中位血小板計(jì)數(shù)23 ×109/L。兩組在性別、年齡、PNH 克隆大小及血象情況基線匹配，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。25 例正常健康體檢者為對照組，其中男14 例、女11 例，年齡19～56 歲、中位年齡38 歲，病例組與對照組在性別、年齡等一般資料方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往確診或新診斷的PNH 患者，包括AA-PNH 患者，PNH 克隆陽性，同時(shí)無自身免疫性疾病病史、近期無感染史，診斷符合國內(nèi)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［5］。排除標(biāo)準(zhǔn)：PNH 克隆陰性或者同時(shí)存在自身免疫性疾病或近期有嚴(yán)重感染者。

本研究通過寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（審查編號：20191009），同時(shí)受試者均知情同意并簽署知情同意書。

2、主要試劑和儀器

鼠 抗 人 CD4-FITC （No. 345621） 、 CD25-PE（No. 558605）、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 - β（TGF- β）1-R PE（IQP-117R）等及各單抗同型對照均為美國Becton Dickinson 公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液（LTS1092PK）、Trizol RNA Reagent（No.28111-03A）、人TGF-β1（No.D622）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（No.D710）試劑盒等均購于美國Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson 公司產(chǎn)品；PCR 儀器為日本Takara公司產(chǎn)品。

3、實(shí)驗(yàn)步驟

3.1、流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞及Th細(xì)胞的亞群、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量 采用細(xì)胞表面分子標(biāo)記方法，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量測定采用單克隆抗體雙標(biāo)法，CD3+CD4+TGF-β+（Th3）細(xì)胞數(shù)量測定采用單克隆抗體三標(biāo)法，細(xì)胞的絕對數(shù)應(yīng)用二步法，將測得的細(xì)胞百分比乘以外周血單個(gè)核細(xì)胞絕對數(shù)即為該細(xì)胞的總數(shù)量。

3.2、叉頭框蛋白P3（FOXP3）及TGF-β 的mRNA 表達(dá)檢測 靜脈血分離得到單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行RNA純度測定，紫外分光光度計(jì)測OD260/280的比值，吸光度OD260/280＞1.8，然后進(jìn)行 RNA 逆轉(zhuǎn)錄，獲得 cDNA，行 PCR 擴(kuò)增檢測，引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，按比例配置反應(yīng)體系，計(jì)算機(jī)分析獲得樣本及內(nèi)參的Ct 值后行數(shù)據(jù)處理。

3.3、TGF-β 及IL-10濃度檢測 收集各組樣本血漿，按照TGF-β1 及IL-10 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，算出濃度。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni 方法校正；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較用H檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、各組T細(xì)胞及Th細(xì)胞的亞群變化

AA-PNH 組CD4+/CD3+細(xì)胞和CD4+/CD8+比例低于對照組，CD8+/CD3+細(xì)胞高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而發(fā)作性 PNH 組與對照組的 CD4+/CD3+細(xì)胞、CD4+/CD8+比例及CD8+/CD3+細(xì)胞的比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 AA-PNH 組 與 發(fā) 作 性 PNH 組 的 Th1/CD3+CD4+細(xì)胞均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組的Th2/CD3+CD4+細(xì)胞比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 PNH患者各亞組與對照組T細(xì)胞及Th細(xì)胞的亞群變化比較

2、各組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th3細(xì)胞變化

AA-PNH 組 及 發(fā) 作 性 PNH 組 CD4+CD25+T 細(xì) 胞 和Th3細(xì)胞的數(shù)量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 PNH患者各亞組與對照組外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞和Th3細(xì)胞的數(shù)量和比例（）

表2 PNH患者各亞組與對照組外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞和Th3細(xì)胞的數(shù)量和比例（）

注：對照組為健康體檢者，PNH為陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥，AA-PNH 為再生障礙性貧血-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿；a指占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例，b指占外周血淋巴細(xì)胞的比例；與對照組相比，cP＜0.05；與AA-PNH組相比，dP＜0.05

比例（%）b 9.89±1.23cd 4.85±1.02c 2.18±0.53 4.762 0.030組別發(fā)作性PNH組AA-PNH組對照組F值P值例數(shù)15 16 25 CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量（×106/L）97.11±17.10cd 67.82±15.67c 43.86±9.52 7.016 0.003比例（%）a 28.03±3.21cd 13.35±2.72c 8.52±1.57 5.107 0.021 Th3細(xì)胞數(shù)量（×106/L）82.27±15.15cd 57.15±10.58c 42.35±9.33 6.354 0.005

3、各組FOXP3及TGF-β的mRNA表達(dá)

發(fā)作性 PNH 組和 AA-PNH 組的 FOXP3 及 TGF-β 的mRNA 陽性表達(dá)率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表3。

表3 PNH患者各亞組與對照組FOXP3及TGF-β的mRNA陽性表達(dá)情況[例（%）]

4、各組TGF-β及IL-10濃度

AA-PNH 組、發(fā)作性 PNH 組 TGF-β 及 IL-10 濃度均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 PNH 患者各亞組與對照組 TGF-β 及 IL-10 的濃度情況（）

注：對照組為健康體檢者，PNH 為陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥，AA-PNH 為再生障礙性貧血-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿；TGF-β 為轉(zhuǎn)化生長因子-β，IL-10 為白細(xì)胞介素-10；與對照組相比，aP＜0.05；與AA-PNH組相比，bP＜0.05

IL-10（pg/ml）7.86±1.17ab 5.57±1.13a 1.33±0.49 5.865 0.008組別發(fā)作性PNH組AA-PNH組對照組F值P值例數(shù)15 16 25 TGF-β（μg/L）49.76±2.03ab 37.29±1.78a 17.01±3.27 5.365 0.012

討 論

PNH 主要特征為造血細(xì)胞表面缺乏糖基磷脂酰肌醇連接蛋白而引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血［6］。至今關(guān)于PNH 克隆如何獲得增殖優(yōu)勢沒有很好的解釋。文獻(xiàn)報(bào)道，骨髓中可能存在選擇壓力有助于發(fā)生基因突變的造血干細(xì)胞增殖，PNH 和再生障礙性貧血的相關(guān)性表明這種選擇壓力是免疫介導(dǎo)的［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，免疫因素和PNH 的發(fā)病及治療反應(yīng)有關(guān)［9］。PNH 患者行同基因骨髓移植時(shí)，使用免疫抑制藥物的預(yù)處理可提高長期緩解率［10］。本研究在探討PNH患者體內(nèi)T細(xì)胞亞群變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)PNH 患者CD4+/CD3+細(xì)胞和CD4+/CD8+比例低于對照組，而CD8+/CD3+細(xì)胞高于對照組，CD4+/CD8+比例倒置；同時(shí)AA-PNH 組與發(fā)作性PNH 組的Th1/CD3+CD4+細(xì)胞均高于對照組，這與既往國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道是一致的，也進(jìn)一步證實(shí)了PNH 存在T 細(xì)胞免疫功能的異常，其可能造成骨髓造血功能衰竭。

對于是否存在T細(xì)胞免疫的負(fù)調(diào)控在PNH 的增強(qiáng)引起PNH 克隆的擴(kuò)增，目前報(bào)道鮮見。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD4+CD25+T 細(xì)胞的抑制效應(yīng)可能通過膜結(jié)合分子間的接觸而起作用，還可能通過抑制性因子如IL-10 和TGF-β 等發(fā)揮作用［11］。Th3細(xì)胞是誘導(dǎo)產(chǎn)生TGF-β并表達(dá)FOXP3細(xì)胞，能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞，抑制Th1 細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子釋放［12］。研究表明，F(xiàn)OXP3 是調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞較為特異性標(biāo)志，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的抑制功能也同F(xiàn)OXP3 的表達(dá)有密切關(guān)系［13-14］。Wolf 等［15］研究表明，F(xiàn)OXP3 表達(dá)量影響卵巢癌患者的總生存及無進(jìn)展生存，其高表達(dá)可逃避免疫監(jiān)視。本研究檢測到AA-PNH 組及發(fā)作性PNH 組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD3+CD4+TGF-β+（Th3）細(xì)胞的數(shù)量以及FOXP3表達(dá)的陽性率均高于對照組，其中以發(fā)作性PNH 組改變最為明顯。表明調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的增多影響了PNH 克隆，繼而影響PNH 造血微環(huán)境，使抑制性細(xì)胞因子如TGF-β 和IL-10 等水平升高，在受到異常抗原刺激時(shí)，擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)T細(xì)胞，使PNH克隆可能逃避免疫監(jiān)視而不被有效清除。

目前一般認(rèn)為，PNH 克隆組成與白血病及其他腫瘤有相似的生物學(xué)特征，Hirai 等［16］認(rèn)為，若阻斷或抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能可能治療異?？寺⌒约膊?。TGF-β 可以誘導(dǎo)FOXP3 的表達(dá)從而維持調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的抑制活性［17-18］。研究表明，TGF-β 的量和是否出現(xiàn)促炎癥細(xì)胞因子決定了FOXP3 表達(dá)，同時(shí)決定了CD4+T 細(xì)胞是否成為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的命運(yùn)［19-20］。本研究結(jié)果顯示，AA-PNH 組、發(fā)作性PNH組的 FOXP3 及 TGF-β 的 mRNA 表達(dá)陽性率和 TGF-β 及IL-10 的濃度均高于對照組，這表明PNH 患者體內(nèi)FOXP3、TGF-β 及 IL-10 均呈高表達(dá)，即 CD4+T 細(xì)胞的免疫負(fù)調(diào)控在PNH 患者中增強(qiáng)，這有可能使PNH 克隆得以逃避免疫監(jiān)視。提示在PNH 的發(fā)病過程中，免疫系統(tǒng)的異常使PNH 克隆增殖。

總之，本研究結(jié)果提示，PNH 患者調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量增多，功能亢進(jìn)，同時(shí)分泌 FOXP3、TGF-β 及 IL-10 細(xì)胞因子增多，提示調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的免疫抑制作用增強(qiáng)，可能在PNH異?？寺≈衅鹆颂颖苊庖弑O(jiān)視的作用，但還需要加大病例數(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突