羅書嵐，劉麗，李肖莉，宋程，賈彬，歐金梅，韓邦興1，**

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230038；2.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；3.安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室，安徽 六安 237012）

傘形科植物白花前胡（Peucedanum praeruptorumDunn）是中國藥典規(guī)定的中藥前胡的唯一來源，具有降氣化痰、散風清熱的功效［1］。近期的藥理學研究表明，白花前胡根提取物具有一定的抗非小細胞肺癌作用［2］，白花前胡乙素能一定程度抑制卵巢癌細胞的增長［3］。白花前胡藥材抽薹前與抽薹后的藥材品質(zhì)差異大，多以抽薹前白花前胡入藥［4］。在傳統(tǒng)栽培過程中，第一年播種出苗后進入營養(yǎng)生長，根部肉質(zhì)肥厚，當年秋、冬季節(jié)采挖，可做藥材，而白花前胡早期抽薹后，植物根部組織結構活性成分含量發(fā)生變化，對白花前胡藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量都有很大程度的影響［5］。目前，對于抽薹后的白花前胡藥用價值降低的機理還不夠明確，原因可能是抽薹后的白花前胡其生長重心是地上部分，白花前胡葉和花的發(fā)育需要消耗大部分的營養(yǎng)物質(zhì)［6］。

近年來植物內(nèi)生菌的研究越來越多，內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段，生活于健康植物的各種組織和器官的細胞間隙或細胞內(nèi)的細菌或真菌［7］。藥用植物內(nèi)生菌與宿主在長期進化的過程中，可能有與宿主相同的次生代謝產(chǎn)物合成途徑，產(chǎn)生和宿主相同或者相似的藥用活性代謝產(chǎn)物［8］。植物次生代謝產(chǎn)物的變化一定程度上受植物內(nèi)生菌多樣性和差異性的影響。

目前，關于白花前胡抽薹前、抽薹后及開花期的內(nèi)生菌的研究尚未見報道，本研究運用宏基因組學的方法以兩年生的白花前胡抽薹前后及開花期的內(nèi)生細菌和真菌為研究對象，系統(tǒng)的研究抽薹前、抽薹后及開花期白花前胡內(nèi)生菌群落多樣性和差異性，豐富了白花前胡內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌的種類與資源。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

白花前胡樣本來自安徽省六安市金安區(qū)東河口，由皖西學院生物與制藥工程學院韓邦興教授鑒定。取兩年生的白花前胡抽薹前樣品（CTQ2），抽薹后樣品（CTH2），開花期樣品（CTF2）為研究對象。

1.2 樣品消毒

樣品消毒方法參考王菅［9］等的方法，將白花前胡植株表面用自來水沖洗干凈并放于超凈工作臺內(nèi)晾干。將白花前胡根剪切分離，并對根的表面進行消毒處理：在0.1%升汞中放置3 min；用無菌水漂洗3次；置于75%的乙醇中浸泡3 min；無菌水漂洗6次；最后用無菌紙擦干表面的水分。將最后一次漂洗的無菌水于室溫避光在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個星期，觀察是否長菌，以此驗證表面消毒是否有效。

1.3 樣品宏基因組測序

用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取DNA，并用瓊脂糖凝膠和Qubit3.0 DNA檢測試劑盒檢測DNA的完整性并對其進行精確定量。PCR所用的引物融合了Miseq測序平臺的V3-V4通用引物及ITS1-2通用引物。15 μL的2×Taq Master Mix、10 μΜBar-PCR primer F和Primer R各1 μL、Genomic DNA10～20 ng，加去離子水到30 μL作為反應體系，然后進行PCR擴增。使用Illumina MiSeqTM平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每個樣本有效數(shù)據(jù)是從Illumina MiseqTM序列抽取序列得到的，使用Usearch去除預處理后序列中的非放大區(qū)域序列，對序列進行序列錯誤修正。此外，通過blastn將去嵌合體序列與數(shù)據(jù)庫的代表序列進行比較，將比閾值低的比較結果作為目標區(qū)域外序列。通過Usearch將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類，基于序列之間97%的相似性將序列分割成不同的操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU），并進行各種OTU分析。使用R的Venn Diagram包 創(chuàng) 建Venn圖，Shannon指 數(shù) 通 過Mothur計算，樣品和群落分布信息在R的gplots包中同時被聚類并顯示在heatmap上，使用線性判別分析及影響因子（Linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析顯示白花前胡內(nèi)生菌中的差異菌。

2 結果與分析

2.1 物種組成（OTU）分析

在97%相似性聚類分析后，3組樣品中共鑒定出2 624個細菌OTUs，其中CTQ2，CTH2，CTF2樣品中內(nèi)生細菌物種OTU數(shù)分別為1 060，1 292，846，3組樣品共有OTU數(shù)為115，占總OTU數(shù) 的4.38%；與其他2組樣品相比，CTH2包含的OTU數(shù)最多，獨有的OTU數(shù)也最多。3組樣品中，CTF2的OTU數(shù) 最 少，CTH2的OTU數(shù) 最 多，見 圖1a。3組樣品中共鑒定出4 281個真菌OTUs，CTQ2，CTH2，CTF2樣品中內(nèi)生真菌物種OTU數(shù)分別為2 066，2 016，1 520，3組樣品共有OTU數(shù)為312個，占總OTU數(shù)的7.29%；CTF2擁有的OTU數(shù)在3組樣品中最少，獨有的OTU數(shù)也最少，見圖1b。綜上，抽薹前、抽薹后及開花期的白花前胡內(nèi)生菌存在差異，白花前胡中內(nèi)生細菌OTU數(shù)比內(nèi)生真菌OTU數(shù)少，且共有OTU數(shù)白花前胡內(nèi)生細菌比例小。

圖1 白花前胡植株內(nèi)生菌物種（OTUs）組成的Venn圖Fig.1 Venn diagram of endophytes（OTUs）in Peucedanum praeruptorum Dunn

2.2 多樣性分析

基于OTU豐富度，用Shannon多樣性指數(shù)分析白花前胡樣本中的微生物多樣性（見圖2），發(fā)現(xiàn)3組樣品多樣性存在一定差異。CTF2的內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)顯著高于CTQ2（P＜0.05），而3組樣品的內(nèi)生真菌無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 內(nèi)生菌群Alpha多樣性評價Fig.2 Alpha diversity estimates of the endophytic communities

2.3 優(yōu)勢菌和差異菌

變形菌門（Proteobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes）廣泛存在于CTQ2、CTH2和CTF2的白花前胡中，疣微菌門（Verrucomicrobia）廣泛存在于CTQ2與CTH2中，為優(yōu)勢菌門。在屬水平上，假單胞菌屬（Pseudomonas）、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、Povalibacter為主要優(yōu)勢細菌屬，從聚類結果看，CTH2，CTF2聚為一類后再與CTQ2聚為一類，見圖3a。

子囊菌門（Ascomycota）等真菌廣泛存在于CTQ2、CTH2和CTF2的白花前胡；在屬水平上，前胡CTQ2、CTH2的瓶霉屬（Phialophora），小球腔菌屬（Leptosphaeria）豐度顯著高于CTF2。從聚類結果看，與內(nèi)生細菌不同的是CTQ2，CTH2聚為一類后再與CTF2聚為一類，見圖3b。

圖3 不同生長時期白花前胡內(nèi)生菌在屬水平的豐度Heatmap圖Fig.3 Heatmap of endophytes in Peucedanum praeruptorum Dunn at genus level in different growth stages.

根據(jù)不同生長時期白花前胡內(nèi)生菌LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，前胡CTQ2，CTH2及CTF2內(nèi)生細菌共有32個差異豐富的分類學分支，內(nèi)生真菌有29個差異豐富的分類學分支（a＝0.01，LDA≥2.0）。在屬水平上，白花前胡CTF2顯著高于其他時期的內(nèi)生細菌有假單胞菌屬（Pseudomonas），Dokdonella，而內(nèi)生真菌僅有蠟殼耳目（Sebacinales）和口蘑科（Tricholomataceae）；CTH2顯著高于其他時期的內(nèi)生細菌有Erwinia，土地桿菌屬（Pedobacter），Limnobacter，Duganella，Mucilaginibacter，玫瑰色半光合菌屬（Roseateles），球衣菌屬（Sphaerotilus），馬賽菌屬（Massilia），Noviher-baspirillum，噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga），寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），內(nèi)生真菌有小球腔菌屬（Leptosphaeria），亞隔孢殼屬（Didymella），背芽突霉屬（Cadophora），鐮刀菌屬（Fusarium），短梗蠕孢屬（Trichocladium），Plectosphaerella，Knufia；CTQ2顯著高于其他時期的內(nèi)生細菌有Citrobacter，環(huán)絲菌屬（Brochothrix）和Mycoplasma，內(nèi)生真菌有叢格孢屬（Berkleasmium），見圖4。.

圖4 不同生長時期白花前胡內(nèi)生菌LEfSe分析圖Fig.4 LEfSe analysis of endophytes in Peucedanum praeruptorum Dunn at different growth stages.

3 討論與結論

本研究結果表明藥用植物內(nèi)生菌可能是影響中藥材質(zhì)量的一個重要因素，內(nèi)生菌的組成受到包括環(huán)境因素［10-11］、季節(jié)因素［12-13］、生長時期［14］等條件的影響。在本研究中，CTF2的內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)顯著高于CTQ2，CTQ2顯著高于其他時期的內(nèi)生細菌菌屬有3個，內(nèi)生真菌菌屬有1個，CTH2顯著高于其他時期的內(nèi)生細菌菌屬有11個，內(nèi)生真菌菌屬有7個，CTF2顯著高于其他時期的內(nèi)生細菌菌屬有2個，表明了抽薹可能是影響白花前胡內(nèi)生菌多樣性與差異性的一個影響因素。本研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、Povalibacter為主要優(yōu)勢細菌屬，前胡CTQ2、CTH2及CTF2內(nèi)生細菌共有32個差異豐富的分類學分支，而內(nèi)生真菌有29個差異豐富的分類學分支（a＝0.01，LDA≥2.0），本研究結果對白花前胡內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌的種類與資源進行了豐富，填補了白花前胡抽薹前、抽薹后及開花期內(nèi)生菌的研究空白。后續(xù)試驗將進一步對抽薹前、抽薹后及開花期的白花前胡內(nèi)生菌進行深入研究并對優(yōu)勢菌進行探索，為解析白花前胡抽薹后不適于藥用的機理提供一定的科學依據(jù)。