姚元謙，呂建林，毛德文，王光耀，陳瑋鈺，黃 嫻

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）在我國的肝衰竭患者中占有很大的比例，主要與乙型肝炎病毒（HBV）感染相關(guān)，常在短時間內(nèi)發(fā)生肝內(nèi)或肝外多器官衰竭，其病情進(jìn)展較快，短期病死率極高[1-2]。目前對于ACLF的治療缺少特效藥物。近年來，隨著人工肝技術(shù)的不斷發(fā)展及對肝衰竭患者管理認(rèn)識的加強(qiáng)，一定程度上提高了ACLF的治療效果，但其預(yù)后仍較差。肝移植是目前最有效的治療措施，但受到肝源及患者經(jīng)濟(jì)條件的制約[3-4]。

解毒化瘀顆粒是毛德文教授在“毒邪病因”原理指導(dǎo)下，總結(jié)得出治療肝衰竭的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有解毒祛邪、化瘀消癥之效，全方由茵陳、大黃、白花蛇舌草、赤芍、郁金、石菖蒲組成[5]。前期研究[6]已表明，解毒化瘀顆?？赏ㄟ^NO-cGMP、NF-κB、c-Met等信號通路治療肝衰竭，涉及Caspase、TNFR I、Gadd45a、SOCS、TGF-β等作用靶點(diǎn)。本研究基于系統(tǒng)評價和生物信息學(xué)方法進(jìn)一步探討解毒化瘀顆粒治療ACLF的臨床療效和作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 以“解毒化瘀顆?！薄案嗡ソ摺薄癑IEDUHUAYU”“Liver Failure”“Hepatic failure”“Acute-on-chronic liver failure”為檢索詞，采用主題詞加自由詞的方式檢索PubMed、Web of Science、Cochrane、Embase、SinoMed、CNKI、VIP、WanFang數(shù)據(jù)庫，檢索時間為建庫至2022年2月。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）研究類型：隨機(jī)對照試驗(yàn)（RCT），文獻(xiàn)語種為中文或英文；（2）研究對象：符合《肝衰竭診治指南》[7]中對ACLF的診斷；（3）干預(yù)措施：治療組需使用解毒化瘀顆粒治療，允許兩組采用同樣的常規(guī)內(nèi)科藥物治療；（4）所納入的文獻(xiàn)應(yīng)含有以下結(jié)局指標(biāo)之一：總有效率、死亡率、MELD評分、血清總膽紅素（TBiL）、血清白蛋白（ALB）、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、凝血酶原活動度（PTA）。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）非隨機(jī)對照試驗(yàn)（RCT），包括綜述類、回顧性研究、動物研究等；（2）數(shù)據(jù)重復(fù)的研究僅納入1項；（3）數(shù)據(jù)無法提取的文獻(xiàn)。

1.3 資料提取及質(zhì)量評價 為確保文獻(xiàn)篩選及數(shù)據(jù)提取錄入準(zhǔn)確無誤，由2名數(shù)據(jù)員進(jìn)行交叉核對。提取信息包括：作者及發(fā)表年份、試驗(yàn)人數(shù)、試驗(yàn)設(shè)計、結(jié)局指標(biāo)等。利用改良Jadad量表進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評估，總分為7分，0～3分為低質(zhì)量文獻(xiàn)，4～7分為高質(zhì)量文獻(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采取相對危險度（RR）、計量資料則采用均數(shù)差（MD）進(jìn)行表示，且均選其95%置信區(qū)間（CI）進(jìn)行描述。使用I2定量檢驗(yàn)進(jìn)行異質(zhì)性分析，當(dāng)I2≤50%時可采取固定效應(yīng)模型（FE），反之則采用隨機(jī)效應(yīng)模型（RM）進(jìn)行合并分析。

1.5 解毒化瘀顆粒的化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測 檢索TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、SymMap（www.symmap.org）數(shù)據(jù)庫獲取各藥物的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件進(jìn)行收集。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載各化學(xué)成分的mol2格式數(shù)據(jù)文件，依次上傳至PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預(yù)測各化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)，并以Norm Fit≥0.5為條件篩選出高概率靶點(diǎn)，然后將各靶點(diǎn)ID上傳至UniProt平臺（https://www.uniprot.org/）統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為GeneSymbol。

1.6 挖掘GEO芯片數(shù)據(jù)并獲取ACLF差異靶點(diǎn) 檢索GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取GSE139602芯片數(shù)據(jù)集，下載該芯片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及GPL13667注釋文件，該組數(shù)據(jù)包括6個健康肝臟樣本及8個ACLF肝臟樣本。運(yùn)用R包“l(fā)imma”等程序包，對2組樣本進(jìn)行差異分析，其中差異靶點(diǎn)的篩選條件為|lgFC|≥1、P＜0.05。使用R包“WGCNA”等程序包進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted correlation network analysis，WGCNA），該方法首先計算出每2個靶點(diǎn)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，通過加權(quán)算法構(gòu)建一個靶點(diǎn)間的無尺度連接網(wǎng)絡(luò)，將具有高度協(xié)同表達(dá)的靶點(diǎn)聚類成模塊，然后計算每個模塊與ACLF樣本、正常樣本之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)，最終篩選出與ACLF顯著相關(guān)且具有共表達(dá)、共調(diào)控屬性的模塊靶點(diǎn)，結(jié)合差異分析進(jìn)一步篩選出其中的差異靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)可能通過協(xié)同作用在ACLF復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制中起到重要影響。

1.7 獲取交集靶點(diǎn)并進(jìn)行PPI、富集分析 應(yīng)用R包“Venn”繪制藥物靶點(diǎn)、差異靶點(diǎn)及WGCNA顯著相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖，并映射出三者的交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)提交至STRING平臺（https://string-db.org/）獲取PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｊ褂肦包“clusterProfiler”對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG富集分析。運(yùn)用Cytoscape軟件繪制化學(xué)成分-基因靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖，并通過網(wǎng)絡(luò)連接度預(yù)測解毒化瘀顆粒治療ACLF的主要化學(xué)成分。

1.8 分子對接驗(yàn)證 選取主要化學(xué)成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載主要化學(xué)成分的MOL2文件，從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）下載蛋白受體的pdb文件，使用PyMOL軟件刪除蛋白受體的水分子及配體，運(yùn)用AutoDock－Tools1.5.6軟件將MOL2文件及pdb文件轉(zhuǎn)換為pdbqt文件，并確定蛋白受體的活性口袋，最后通過AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 共檢索獲得文獻(xiàn)201篇，嚴(yán)格按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)，最終納入10項[8-17]RCTs進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。文獻(xiàn)篩選過程及文獻(xiàn)基本資料見圖1、表1。

表1 納入文獻(xiàn)的基本資料

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 文獻(xiàn)質(zhì)量評價結(jié)果 改良Jadad評分量表評估顯示，有8篇文獻(xiàn)[8-9,11-16]達(dá)到4分，表明分析質(zhì)量較高。（見表1）有2篇文獻(xiàn)[10,17]僅提及隨機(jī)未描述具體隨機(jī)方法，其余文獻(xiàn)均使用了隨機(jī)數(shù)字表法，除1項文獻(xiàn)[17]外，其他文獻(xiàn)均報告了死亡病例，其中有4篇文獻(xiàn)[10,12-14]描述了因失訪或退出造成病例脫落，10篇文獻(xiàn)均未提及分配隱藏、盲法等具體內(nèi)容。利用Cochrane提供的偏倚風(fēng)險評價工具進(jìn)行偏倚評估。（見圖2）

圖2 偏倚風(fēng)險評估圖

2.3 Meta分析結(jié)果 根據(jù)隨訪時間的不同，分成4周和8周兩個亞組進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示，在總有效率、死亡率、MELD評分、TBiL、ALB、ALT和PTA指標(biāo)上，治療組均優(yōu)于對照組（P＜0.05）。在治療時間方面，總體上第8周的治療效果優(yōu)于第4周，表明持續(xù)使用解毒化瘀顆粒進(jìn)行治療，可使ACLF患者獲得更佳的療效。Meta分析結(jié)果見表2。

表2 Meta 分析結(jié)果

續(xù)表2：

2.4 篩選藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn) 通過TCMSP、SymMap數(shù)據(jù)庫檢索、篩選獲得84個化學(xué)成分，上傳至PharmMapper篩選獲得682個藥物靶點(diǎn)。對GSE139602芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選獲得768個差異靶點(diǎn)，其在ACLF樣本中表達(dá)上調(diào)的靶點(diǎn)有381個、表達(dá)下調(diào)的靶點(diǎn)有387個。（見圖3）通過WGCNA分析，篩選出與正常樣本、ACLF樣本相關(guān)性最高的靶點(diǎn)，圖中綠色模塊和棕色模塊相關(guān)性最高，共1 175個靶點(diǎn)。（見圖4）

圖3 差異分析火山圖

圖4 WGCNA 分析

2.5 獲取交集靶點(diǎn)及PPI分析 將藥物靶點(diǎn)、差異靶點(diǎn)及WGCNA靶點(diǎn)導(dǎo)入R軟件，繪制韋恩圖，共映射出52個交集靶點(diǎn)。構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)有CYP3A4、CYP1A2、CYP1A1、ABCG2等。（見圖5）

圖5 交集靶點(diǎn)分析

2.6 交集靶點(diǎn)富集分析 對52個交集靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO、KEGG富集分析，得到生物學(xué)進(jìn)程（BP）219條，主要包括類固醇代謝、激素代謝、酒精代謝過程等；得到細(xì)胞組分（CC）9條，主要包括細(xì)胞基質(zhì)連接、黏著斑、囊泡腔等；得到分子功能（MF）41條，主要包括鐵離子結(jié)合、四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合等；得到信號通路19條，主要包括化學(xué)致癌作用-受體激活、亞油酸代謝、類固醇激素生物合成、細(xì)胞色素P450代謝、花生四烯酸代謝、膽汁代謝通路等。（見圖6～7）

圖6 交集靶點(diǎn)GO 富集分析

圖7 交集靶點(diǎn)KEGG 富集分析

2.7 構(gòu)建化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 為了更清晰地展示解毒化瘀顆粒治療ACLF的化學(xué)成分、交集靶點(diǎn)與作用通路之間的關(guān)系，故構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖8）通過網(wǎng)絡(luò)圖可直觀看出，解毒化瘀顆粒對ACLF具有多途徑、多成分的作用機(jī)制。根據(jù)Degree值，預(yù)測其治療ACLF的主要化學(xué)成分。（見表3）

圖8 化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路圖

表3 解毒化瘀顆粒治療ACLF 的主要化學(xué)成分

2.8 分子對接驗(yàn)證 選取7個主要化學(xué)成分及8個核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，一般認(rèn)為結(jié)合能（Affinity）＜-4.25 kcal/mol則配體與靶點(diǎn)受體之間有結(jié)合活性，Affinity＜-5.0 kcal/mol表明匹配活性較佳，Affinity＜-7.0 kcal/mol提示具有較強(qiáng)的對接活性。分子對接結(jié)果見圖9，56組對接得分均＜-5.0 kcal/mol，最低得分為-6.2 kcal/mol（NQO1-β谷甾醇），最高得分為-11.9 kcal/mol（CYP1A1-鞣花酸），平均得分為-8.78 kcal/mol，表明篩選出的靶點(diǎn)與化學(xué)成分間具有較好的匹配度。選取部分對接結(jié)果進(jìn)行展示。（見圖10）

圖9 主要化學(xué)成分-核心靶點(diǎn)分子對接熱圖

圖10 分子對接展示圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)將肝衰竭歸屬于“急黃”“瘟黃”等范疇，病位在肝膽，連及脾腎，病機(jī)上多屬于正虛邪實(shí)[18]。面對ACLF發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性及證候的多變性，中醫(yī)學(xué)從整體出發(fā)辨證施治，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，配合中醫(yī)藥治療，極大程度改善了患者預(yù)后，降低了病死率。解毒化瘀顆粒是毛德文教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定的驗(yàn)方，多項臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明其能有效干預(yù)肝衰竭的進(jìn)展，如柏文婕等[19]對68例肝衰竭患者加用解毒化瘀顆粒發(fā)現(xiàn)，其能夠調(diào)節(jié)肝衰竭患者的免疫功能、減輕肝臟炎癥；呂建林等[20]對180只SPF級Wistar大鼠的研究表明，解毒化瘀顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)Mfn1和Mfn2的表達(dá)抑制線粒體分裂，推動線粒體結(jié)合，降低碎片化現(xiàn)象，保護(hù)線粒體，從而對肝衰竭大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究對10項RCTs進(jìn)行Meta分析（共601例患者）發(fā)現(xiàn)，加用解毒化瘀顆粒（治療組）治療ACLF優(yōu)于單用西醫(yī)治療（對照組）。經(jīng)過4周、8周的治療周期后，在總有效率、死亡率、MELD評分、TBiL、ALB、ALT、PTA指標(biāo)方面，治療組均優(yōu)于對照組（P ＜0.05），如在ALT 指標(biāo)上，第4 周的分析結(jié)果為MD=-33.88，95%CI（-45.66，-22.10），P＜0.000 01，第8周的分析結(jié)果為MD=-19.45，95%CI（-25.63，-13.27），P＜0.000 01。同時可以看出，第8周的治療效果優(yōu)于第4周，表明持續(xù)使用解毒化瘀顆粒進(jìn)行治療，可使ACLF患者獲得更佳的療效。

通過生物信息學(xué)進(jìn)一步分析解毒化瘀顆粒治療ACLF的作用機(jī)制，PPI拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)主要為細(xì)胞色素P450（CYP450）氧化酶家族成員，如CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9等，此外還有ABCG2、ADK、NQO1。CYP450酶在藥物、類固醇、致癌物及許多化學(xué)品的代謝中起到重要作用。臨床上90%的藥物需經(jīng)CYP450酶代謝，能力最強(qiáng)的成員為CYP3A4，是人體含量最豐富的肝藥酶。其活性被誘導(dǎo)或被抑制會導(dǎo)致某些外源性物質(zhì)產(chǎn)生肝毒性，從而引起肝損傷，甚至有研究認(rèn)為該基因的高表達(dá)與惡性腫瘤進(jìn)展有關(guān)[22]。醌氧化還原酶（NQO1）在肝細(xì)胞內(nèi)起到抗氧化作用，其表達(dá)水平受Nrf2信號通路調(diào)控，NQO1的誘導(dǎo)或敲除分別與氧化應(yīng)激易感性的降低或增加有關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)肝衰竭大鼠NQO1等因子的表達(dá)，能夠緩解細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[24]。

對52個交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀顆粒干預(yù)ACLF的生物途徑主要涉及類固醇代謝、激素代謝、酒精代謝、細(xì)胞基質(zhì)連接、黏著斑、囊泡腔、鐵離子結(jié)合、四吡咯結(jié)合等，而KEGG信號通路主要有化學(xué)致癌作用-受體激活、亞油酸代謝、類固醇激素生物合成、細(xì)胞色素P450代謝通路、花生四烯酸代謝、膽汁代謝等。亞油酸是不飽和脂肪酸的一種，屬于人體必需脂肪酸。它們的衍生物如前列腺素、血栓素和白三烯等，參與炎癥和免疫等重要病理過程[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)亞油酸可通過抑制肝星狀細(xì)胞的激活或增殖來改善脂肪肝纖維化?；ㄉ南┧崾巧矬w內(nèi)分布最廣泛的一種omega-6多不飽和脂肪酸，是許多生物活性物質(zhì)的直接前體[27]；細(xì)胞色素P450代謝途徑能將花生四烯酸代謝為二十碳三烯酸和類花生酸等；研究表明兩者能起到抑制肝臟炎癥、減少細(xì)胞凋亡、抗肝纖維化的作用[28-29]。

解毒化瘀顆粒中治療ACLF的主要化學(xué)成分有7個，這些化學(xué)成分均具有廣泛的藥理活性，如8-異戊烯基山奈酚有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌等作用[30]。異鼠李素同樣有著豐富的藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)其能夠有效緩解藥物誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，且保護(hù)作用與其抗炎和抗氧化作用有關(guān)，可能是通過調(diào)控MAPK/Nrf-2等信號通路發(fā)揮作用[31]。亦有研究表明，異鼠李素可抑制肝星狀細(xì)胞活化并降低細(xì)胞外基質(zhì)的形成和自噬，有顯著的抗肝纖維化作用[32]。

綜上所述，解毒化瘀顆粒治療ACLF具有多途徑、多成分的作用機(jī)制，包括抑制肝臟炎癥、抗肝纖維化、減少脂質(zhì)蓄積、抗氧化、改善肝功能等作用。本研究通過對解毒化瘀顆粒的Meta分析及生物信息學(xué)分析表明，其治療ACLF療效確切，且具有豐富的作用機(jī)制。