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        基于16S rRNA高通量測(cè)序分析9種中藥飲片污染微生物群落特征*

        2022-11-15 04:26:18鄒惠亮
        中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2022年9期
        關(guān)鍵詞:膽鹽氏菌高通量

        陳 柯,陳 敏,林 黎,鄒惠亮

        (湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江 湖州 313000)

        中藥飲片是一種特殊的藥品類型,是指中藥材經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)呐谥坪笾瞥傻目芍苯佑糜谥嗅t(yī)臨床或制劑生產(chǎn)使用的一類藥品。中藥飲片來(lái)源多樣,特別是植物和動(dòng)物來(lái)源的飲片在加工炮制、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中容易受到微生物污染,從而影響中藥飲片的藥效和質(zhì)量安全[1]。近年來(lái),在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局展開(kāi)的質(zhì)量抽檢活動(dòng)中多次發(fā)現(xiàn)中藥飲片質(zhì)量不合格,其中微生物污染是導(dǎo)致其合格率低的重要原因之一[2-3]。目前,《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)中對(duì)中藥飲片微生物限度的檢查方法沿用的仍然是傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法,但這種方法的檢出率較低,有研究[4]表明,平板培養(yǎng)只能獲得不到1%的可培養(yǎng)微生物,這無(wú)法全面反映受污染的中藥飲片的微生物的實(shí)際情況,而病原微生物的污染卻有可能對(duì)人體帶來(lái)極其嚴(yán)重的危害。因此,對(duì)中藥飲片中的微生物群落特征進(jìn)行鑒定具有重要意義。隨著分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展,高通量測(cè)序可以同時(shí)對(duì)海量的基因序列進(jìn)行測(cè)定,具有高輸出量和高解析度的優(yōu)點(diǎn)[5],可以在大大縮短時(shí)間的同時(shí)提供豐富的遺傳學(xué)信息。本研究擬采用高通量測(cè)序?qū)φ憬『菔心咸貐^(qū)9種中藥飲片(每個(gè)品種10個(gè)批次,共計(jì)90批)進(jìn)行16S核糖體RNA(16S rRNA)測(cè)序,獲得其污染微生物的菌落特征,了解中藥飲片微生物污染的實(shí)際情況,以期為中藥飲片微生物限度的控制提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器與試劑 Miseq核酸測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)、QuantStudioTM 6 Flex實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(賽默飛世爾科技公司)、SH-2020A全自動(dòng)瓊脂凝膠糖電泳儀(北京金桑特醫(yī)用儀器有限公司)、MiSeq DNA Flex制備試劑盒(美國(guó)Illumina公司)、SYBR Premix Ex Taq ⅡDNA聚合酶試劑盒(日本TAKARA公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 中藥飲片采集 柴胡、白術(shù)、山藥、玄參、麥冬、焦梔子、砂仁、鐵皮楓斗、金銀花共計(jì)9種來(lái)源于南太湖地區(qū)的中藥飲片品種,每個(gè)品種10個(gè)批次,共收集中藥飲片樣品90批。每批取100 g樣品在無(wú)菌條件下進(jìn)行粉碎,取粉末待測(cè)。

        1.2.2 控制菌檢查 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部[6]中關(guān)于中藥飲片微生物限度檢查法的相關(guān)要求進(jìn)行耐膽鹽革蘭氏陰性菌和沙門(mén)菌的檢查。

        (1)耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢查:取10 g待測(cè)樣品,與TSB培養(yǎng)基以1∶10的比例進(jìn)行混合,在20~25 ℃條件下培養(yǎng)2 h,取相當(dāng)于供試品0.1 g的預(yù)培養(yǎng)物接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中,于35 ℃條件下培養(yǎng)48 h,然后于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線接種,接種后繼續(xù)于35 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

        (2)沙門(mén)氏菌檢查:取10 g待測(cè)樣品,與TSB培養(yǎng)基以1:10的比例進(jìn)行混合,在33 ℃條件下培養(yǎng)24 h,取0.1 mL培養(yǎng)物接種至10 mL RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)基,繼續(xù)33 ℃培養(yǎng)24 h,然后于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線接種,接種后繼續(xù)于33 ℃條件下培養(yǎng)48 h。

        (3)菌落鑒定:挑取上述平板培養(yǎng)基中不同形態(tài)的微生物菌落,再次劃線接種于TSA平板培養(yǎng)基中,分離純化后采用VITEK生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

        1.2.3 高通量測(cè)序 先采用DNA試劑盒抽提DNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物設(shè)計(jì)如下:

        上游引物:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’;

        下游引物:926R5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’。

        擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,95℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,72 ℃保持7 min,共35個(gè)循環(huán)。分別對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V4-V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,分別測(cè)定260 nm和280 nm下的吸光度值(OD值),并采用兩者的比值評(píng)價(jià)DNA的純度。然后采用凝膠回收試劑盒回收PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物,并以其為模板,進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增,獲得的PCR產(chǎn)物,采用Quanti FluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,然后按照測(cè)序要求進(jìn)行混勻,采用MiSeq Reagent Kit v3(2×300 cycle)芯片進(jìn)行測(cè)序。

        1.2.4 多樣性分析 測(cè)得的序列采用FLASH和Trimmomatic軟件進(jìn)行序列優(yōu)化,獲得有效序列,將最終優(yōu)化后的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì),并對(duì)上述序列進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)分類,以97%的相似度聚類成同一個(gè)OUT,給予OUT序列進(jìn)行α多樣性(alpha diversity)分析,獲得豐富度指數(shù)(Chaol指數(shù))和多樣性指數(shù),多樣性指數(shù)包括香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和辛普森指數(shù)(Simpson index),在各分類水平上進(jìn)行微生物群落特征分析。

        2 結(jié)果

        2.1 控制菌檢查結(jié)果 90批中藥飲片中有1批山藥檢測(cè)出沙門(mén)菌和大腸埃希菌,有41批檢出耐膽鹽革蘭氏陰性菌,各中藥飲片的的耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率見(jiàn)表1。其中檢出率最低的3種為焦梔子、麥冬和鐵皮楓斗,檢出率最高的3種為山藥、金銀花和白術(shù),這3種飲片耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率明顯高于其它中藥飲片,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),總檢出率為45.56%。

        表1 9 種中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率

        2.2 菌落鑒定結(jié)果 9種中藥飲片中共鑒定出腸桿菌科、假單胞菌科、巴斯德氏菌科、莫拉菌科4個(gè)科的污染微生物,其中腸桿菌科檢出比例最高。鑒定出的微生物包括腸桿菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、克羅諾桿菌屬、沙門(mén)氏菌屬、埃希菌屬、巴斯德氏菌屬、克雷伯氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、變形桿菌屬共10個(gè)屬。鑒定出的微生物包括產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、成團(tuán)泛菌、赫氏埃希菌、銅綠假單胞菌、中間腸桿菌、阪崎克羅諾桿菌、沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌、多殺巴斯德氏菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、產(chǎn)粘變形桿菌、奇異變形桿菌共15個(gè)種。(見(jiàn)表2)

        表2 9 種中藥飲片微生物鑒定結(jié)果

        2.3 16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果 通過(guò)高通量測(cè)序獲得上述9種中藥飲片的有效序列,并對(duì)所有有效序列進(jìn)行Tags聚類分析,并在97%的相似度下進(jìn)一步進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類分析。其中柴胡、砂仁和山藥獲得最多有效序列,分別為33 691、33 284、33 169,鐵皮楓斗獲得最少的有效序列。所有樣品經(jīng)OTUs分析共計(jì)產(chǎn)生1 322個(gè)OTUs,其中前三位為柴胡、金銀花、山藥,其OTUs數(shù)量分別為184、173、162。(見(jiàn)表3)對(duì)上述樣品在97%的相似度閾值下進(jìn)行α多樣性分析,共獲得186種污染微生物,并獲得各樣品的豐富度指數(shù)(Chaol指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))。(見(jiàn)表4)Chaol指數(shù)越大說(shuō)明豐富度越高,Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)越大說(shuō)明多樣性越高。

        表3 9 種中藥飲片高通量測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)

        2.4 屬水平微生物分布情況 在屬水平對(duì)9種中藥飲片中的污染微生物進(jìn)行統(tǒng)計(jì),相對(duì)豐富≥0.01的污染微生物共有32個(gè)屬,優(yōu)勢(shì)均屬為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、變形桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、克羅諾桿菌屬、克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬。其中柴胡、玄參、鐵皮楓斗的優(yōu)勢(shì)菌屬為腸桿菌屬,白術(shù)、山藥、焦梔子、砂仁、金銀花的優(yōu)勢(shì)菌屬為泛菌屬,麥冬的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌。(見(jiàn)圖1)

        圖1 9 種中藥飲片屬水平微生物相對(duì)豐富分布情況

        3 討論

        本研究選取的研究對(duì)象為9種常見(jiàn)的中藥飲片[7],控制菌檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率為45.56%,沙門(mén)菌和大腸埃希菌也被檢出。沙門(mén)氏菌是誘發(fā)傷寒和急性腸胃炎的主要元兇,嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)敗血癥,危急生命安全[8]。大腸埃希菌正常情況下對(duì)人體無(wú)害,但某些類型的大腸埃希菌能通過(guò)產(chǎn)生內(nèi)毒素來(lái)誘發(fā)腹瀉[9]。本次結(jié)果還發(fā)現(xiàn)焦梔子、麥冬和鐵皮楓斗這3種經(jīng)過(guò)炒制或者加熱烘干的飲片的檢出率最低。范一靈等[10]對(duì)100批中藥飲片進(jìn)行需氧菌、霉菌、酵母菌及耐熱菌檢測(cè),發(fā)現(xiàn)耐熱菌檢出率為61%,微生物風(fēng)險(xiǎn)殘留較高。甘永琦等[11]對(duì)廣西等地區(qū)9種中藥飲片的微生物污染現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)莖類飲片耐膽鹽革蘭氏陰性菌和耐熱菌污染率較高,而果實(shí)類飲片霉菌污染率較高。經(jīng)鑒定9種中藥飲片中共鑒定出4個(gè)科、10個(gè)屬共15種污染微生物。其中除沙門(mén)氏菌外,還檢測(cè)出了陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、奇異變形桿菌等重要的條件致病菌。微生物污染不僅有可能影響中藥飲片的質(zhì)量和療效,還可能影響其安全性[12]。該結(jié)果提示中藥飲片中的病原菌微生物污染不容忽視。

        為了對(duì)中藥飲片中的微生物污染情況進(jìn)行全面分析,本研究進(jìn)一步采用高通量測(cè)序,結(jié)果在柴胡、砂仁和山藥獲得最多有效序列,通常認(rèn)為一個(gè)有效序列來(lái)自于一種菌,提示這3種中藥飲片中的基因信息最多。再進(jìn)一步進(jìn)行OTUs聚類分析以獲得各種中藥飲片中微生物的種屬信息,結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡、白術(shù)和山藥具有最高的Chaol指數(shù),柴胡、山藥和砂仁具有最高的Shannon指數(shù),柴胡、山藥和砂仁具有最高的Simpson指數(shù)。而麥冬、焦梔子和鐵皮楓斗這3種飲片觀察到的微生物種類,以及Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都相對(duì)最低,這可能是由于其炮制過(guò)程有經(jīng)過(guò)炒制和加熱有關(guān),該結(jié)果與前文控制菌檢查結(jié)果有相似之處。其中,Chaol指數(shù)越代表物種數(shù)量,Chaol指數(shù)越高,群落的豐富度越高;Shannon指數(shù)是描述的是種的個(gè)體出現(xiàn)的紊亂和不確定性,Shannon指數(shù)越高,群落的多樣性也就越高;Simpson指數(shù)指數(shù)代表的是群落中種數(shù)個(gè)體分配的均勻程度,Simpson指數(shù)越高,群落多樣性越好。這3種指數(shù)是通過(guò)不同的算法來(lái)反應(yīng)微生物群落的豐富度和均勻度,指數(shù)越高,通常代表微生物群落的多樣性越豐富[13-14],以上結(jié)果提示柴胡、白術(shù)、山藥和砂仁這4種中藥飲片中的微生物多樣性最為豐富,而麥冬、焦梔子和鐵皮楓斗中的微生物多樣性最少。

        高通量測(cè)序共獲得186種污染微生物,其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于控制菌檢出的15種污染微生物,且各種飲片在屬水平上具有很大差異,檢出最多的屬為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、變形桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、克羅諾桿菌屬、克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬。甘永琦等[15]通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)和高通量測(cè)序?qū)Χ喾N中藥飲片中的耐膽鹽微生物群落進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)最主要的微生物為腸桿菌科和假單胞菌科,屬水平上檢出率最高為腸桿菌屬和泛菌屬,與本研究有相似之處。腸桿菌屬包含陰溝腸桿菌等能誘發(fā)下呼吸道感染、軟組織感染的病原菌,這類病原菌對(duì)消毒劑和抗生素具有強(qiáng)烈的抵抗力,具有較強(qiáng)的耐藥性[16]。假單胞菌屬的銅綠假單胞菌是繼發(fā)性感染的主要條件致病菌,變形桿菌可導(dǎo)致腹膜炎、腦膜炎和敗血癥等,鮑曼不動(dòng)桿菌可導(dǎo)致呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎等多種感染性疾病,肺炎克雷伯氏菌可以導(dǎo)致肺炎和敗血癥[17]。以上微生物都是引起醫(yī)院感染的重要病原菌。除了控制菌檢出的污染微生物外,芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等菌屬僅在高通量測(cè)序中檢出,且經(jīng)相對(duì)豐度指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)麥冬的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌。而這些菌屬是主要的致病菌和條件致病菌所在屬,金黃色葡萄球菌能引發(fā)食物中毒和多種化膿性炎癥;鏈球菌屬包含肺炎鏈球菌等多種致病菌,能引起各種化膿性炎癥、猩紅熱、敗血癥、腦膜等多種臨床疾??;腸球菌屬對(duì)多種抗菌藥具有固有耐藥性,是僅次于葡萄球菌屬的最重要的醫(yī)院感染病原菌。

        綜上所述,中藥飲片中存在微生物污染情況,并包含致病菌,具有一定的致病風(fēng)險(xiǎn)。高通量測(cè)序可以無(wú)需通過(guò)微生物培養(yǎng)即可獲得中藥飲片中的微生物群落特征信息,與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)相比較,更加快速和全面。

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