陳 鵬，馬嘉澤，張加敏，胡俊杰，李萬(wàn)里，程議樂，李曉柳，丁 康

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要臨床癥狀為反復(fù)發(fā)作或持續(xù)的腹瀉、腹痛、黏液血便伴里急后重等[1]。由于本病病程遷延難愈，癥狀反復(fù)發(fā)作，且目前為止仍無(wú)根治的藥物和方法，約30%的UC患者需行全結(jié)直腸切除術(shù)，具有很高的致殘率，給患者家庭及社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)壓力及醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2-3]。中醫(yī)學(xué)通過辨證論治、整體觀念特色相結(jié)合治療UC，具有療效確切、作用范圍廣泛、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在誘導(dǎo)緩解、防止疾病復(fù)發(fā)、提高患者生活質(zhì)量等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)[4-5]。近年來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)開始報(bào)道UC與腸道菌群的關(guān)系，腸道菌群失衡在UC發(fā)生發(fā)展過程中的啟動(dòng)和促進(jìn)作用已達(dá)成共識(shí)[6]。許多天然藥物的化學(xué)成分（如酚酸類化合物）均可通過調(diào)節(jié)腸道菌群、炎癥因子緩解UC[7]。研究也發(fā)現(xiàn)對(duì)不同證型的UC患者辨證使用中藥復(fù)方均能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，修復(fù)腸道黏膜損傷[8]。

潰結(jié)灌腸液是國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)“丁氏中醫(yī)診療法”的重要組成部分，作為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，其療效確切[9-10]。潰結(jié)灌腸液Ⅱ由原方去除輕粉化裁而來(lái)，前期的臨床研究和基礎(chǔ)研究證明該藥治療UC療效明確，與潰結(jié)灌腸液原方相當(dāng)[11-12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科理論，運(yùn)用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)模擬及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等技術(shù)，揭示藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性和綜合性與中藥多成分、多靶點(diǎn)、整體性的特點(diǎn)具有高度的相似性[13-14]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩查潰結(jié)灌腸液Ⅱ改善UC菌群結(jié)構(gòu)及炎癥的主要成分和靶點(diǎn)，并以小鼠為研究對(duì)象，探究潰結(jié)灌腸液Ⅱ?qū)ζ暇厶橇蛩徕c鹽（DSS）造模小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和炎癥因子的調(diào)節(jié)作用，從菌群平衡角度闡明其治療UC的機(jī)制及現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩查潰結(jié)灌腸液Ⅱ改善UC菌群結(jié)構(gòu)和炎癥的主要活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)

1.1 潰結(jié)灌腸液Ⅱ主要活性成分及作用靶點(diǎn)的搜集和校正利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集金銀花、地榆、白及、乳香、沒藥的主要活性成分，以Caco-2細(xì)胞滲透性≥-0.4、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件[15-16]。對(duì)于人工牛黃、海螵蛸、珍珠粉、煅石膏、煅爐甘石5味動(dòng)物或礦物類中藥，查閱相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充遺漏的有效成分。然后通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得其2D分子結(jié)構(gòu)，利用Swiss Target Prediction 平臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)主要化學(xué)成分作用的靶點(diǎn)。最后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行靶點(diǎn)信息比對(duì)和基因名稱校正。

1.2 UC的疾病靶點(diǎn)檢索和蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）的構(gòu)建 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索UC和腸道菌群失衡相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。將UC及腸道菌群失衡疾病靶點(diǎn)與藥物主要成分作用的靶蛋白取交集，用R軟件制作韋恩圖。將藥物成分-疾病交集基因數(shù)據(jù)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）中構(gòu)建PPI圖。分別導(dǎo)出TSV文件，上傳至Cytoscape3.7.1，計(jì)算各主要蛋白之間的互作次數(shù)，并據(jù)此找到關(guān)鍵基因。

1.3 GO功能富集與KEGG通路富集分析 將上述交集基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org）進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用R軟件作圖。

1.4 活性成分-靶點(diǎn)-富集通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潰結(jié)灌腸液Ⅱ的主要藥物成分、疾病交集基因、富集通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，制作“活性成分-靶點(diǎn)-富集通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得出關(guān)鍵化學(xué)成分。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只C57BL/6J雄性小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由杭州醫(yī)學(xué)院提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，濕度50%～60%，明暗周期12 h，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，可自由獲取食物和水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的操作和處理均嚴(yán)格按照南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)有關(guān)章程進(jìn)行，倫理批件號(hào)：202109A034。

2.2 藥物與試劑 葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）（批號(hào)：60316ES60）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；三氯甲烷（氯仿）（批號(hào)：10006818）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇（批號(hào)：1011101）購(gòu)自上海申博化工有限公司；DEPC水（批號(hào)：R0021）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（批號(hào)：R401-01）、HiScript III RT SuperMix for qPCR（批號(hào)：R323）均購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

2.3 主要儀器 KZ-II型高速組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；Micro 21R型高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；DM500型光學(xué)顯微鏡（德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)）；CFX Connect熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

2.4 造模與分組 使用DSS誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠UC疾病模型[17]。采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10只小鼠作為空白對(duì)照組，空白對(duì)照組小鼠自由飲水，其余26只小鼠均自由飲用5%葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）溶液7 d，監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量、糞便狀態(tài)和便血情況，評(píng)估小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI），小鼠出現(xiàn)腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕等癥狀可視為UC急性期模型復(fù)制成功。造模死亡小鼠1只，造模成功率96.15%（25/26）。將造模成功小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法選取10只小鼠作為給藥組，剩余15只小鼠作為模型對(duì)照組。

2.5 實(shí)驗(yàn)給藥 根據(jù)非標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量動(dòng)物的校正系數(shù)表[18]，人與22 g非標(biāo)準(zhǔn)小鼠換算系數(shù)約為11.95，折算小鼠潰結(jié)灌腸液Ⅱ用量為4.2 g/kg。造模第5天時(shí)造模組小鼠體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.05），視為UC急性期模型造模成功。從造模第6天起，給藥組小鼠給予4.2 g/kg潰結(jié)灌腸液Ⅱ灌腸，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水灌腸，1次/d，連續(xù)灌腸5 d。給藥期間，模型對(duì)照組小鼠死亡2只。

2.6 觀察指標(biāo)

2.6.1 一般情況觀察 在整個(gè)研究過程中每日觀察、記錄各組小鼠一般情況及體質(zhì)量變化，一般情況主要包括精神狀態(tài)、活動(dòng)狀態(tài)、食欲、排便等。

2.6.2 16S rDNA測(cè)序分析小鼠腸道菌群變化 研究第11天采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，剖腹取出小鼠結(jié)腸組織，用直尺測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并拍照記錄。沿腸道縱行剖開整段結(jié)腸，并收取結(jié)腸內(nèi)容物，其余結(jié)腸組織凍存于-80 ℃冰箱中。用預(yù)冷的生理鹽水沖洗結(jié)腸，濾紙吸干水分，觀察結(jié)腸黏膜炎癥情況及潰瘍數(shù)量。挑選病變嚴(yán)重處的潰瘍及附近的結(jié)腸黏膜組織保存于4%中性甲醛溶液中24 h，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚切片，HE染色固定，顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜，并拍照記錄。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成16S rDNA測(cè)序分析小鼠腸道菌群，結(jié)合測(cè)序結(jié)果分析找到各組間微生物菌群的差異。

2.6.3 PCR檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）mRNA及白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）mRNA表達(dá) 取小鼠結(jié)腸組織適量，加入RNA isolater Total RNA完成勻漿，按說(shuō)明書提取總RNA。通過分光光度計(jì)計(jì)算RNA濃度，滿意后取樣品5 μg，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再取待測(cè)樣品cDNA按說(shuō)明書配制成總體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系，按95 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以參照基因GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析，引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.6.4 腸道菌群與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相關(guān)性分析 利用heatmap圖通過相關(guān)性數(shù)值可視化展示菌群與炎癥因子之間的關(guān)系，評(píng)估腸道菌群與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相關(guān)性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，符合正態(tài)分布者，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者，采用秩和檢驗(yàn)，對(duì)于重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 主要藥物成分及其作用靶點(diǎn) 通過TCMSP搜集潰結(jié)灌腸液Ⅱ中金銀花、地榆、白及、乳香、沒藥主要化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，獲得金銀花主要化學(xué)成分17個(gè)，地榆7個(gè)，白及7個(gè)，乳香8個(gè)，沒藥43個(gè)；通過文獻(xiàn)挖掘補(bǔ)充記錄海螵蛸[19-20]主要成分17個(gè)，珍珠粉[21]主要成分19個(gè)，人工牛黃[22]主要成分6個(gè)，煅石膏[23]主要成分1個(gè)，煅爐甘石[24]主要成分2個(gè)。將通過TCMSP、Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)的相關(guān)靶點(diǎn)映射到Uniprot進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)化命名，最終去重后得到891個(gè)靶蛋白。

3.2 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò) 通過R軟件將潰結(jié)灌腸液Ⅱ主要成分作用的891個(gè)靶蛋白和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的4 837個(gè)UC基因、87個(gè)腸道菌群失衡基因取交集，得到23個(gè)共有靶點(diǎn)。（見圖1）將23個(gè)共有靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)間的蛋白互作分析，物種選擇人類，置信度設(shè)定為＞0.4，隱藏沒有互作關(guān)系的靶蛋白，構(gòu)建PPI圖。（見圖2）基因蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)包含23個(gè)節(jié)點(diǎn)、132條邊，平均度值（Degree）為11.5。1個(gè)節(jié)點(diǎn)Degree代表與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的條數(shù)，具體見表2。

圖1 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC及腸道菌群失衡基因交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC 及腸道菌群失衡基因交集靶點(diǎn)PPI 圖

表2 交集靶點(diǎn)度值表

3.3 GO分析和KEGG分析 將上述23個(gè)交集基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用R軟件作圖。（見圖3～4）圖3中縱軸表示GO名稱，橫軸表示富集數(shù)量，綠色為分子功能，橙色為細(xì)胞組分，藍(lán)色為生物過程。在生物過程中，細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、血管發(fā)育的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對(duì)外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)等顯著富集；在分子功能中，細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、抗氧化活性等顯著富集；在細(xì)胞組分中，膜側(cè)、質(zhì)膜外側(cè)、內(nèi)吞囊泡、細(xì)胞頂端、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等顯著富集。圖4中縱軸表示通路名稱，橫軸表示富集因子，氣泡顏色表示富集顯著性，氣泡大小表示富集數(shù)量。通過KEGG分析顯示，炎癥性腸病、IL-17信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、致病性大腸桿菌感染、沙門氏菌感染、志賀氏菌病等顯著富集。

圖3 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC及腸道菌群失衡基因交集靶點(diǎn)GO分析

圖4 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC 及腸道菌群失衡基因交集靶點(diǎn)KEGG 分析

3.4 活性成分-靶點(diǎn)-富集通路網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-富集通路網(wǎng)絡(luò)，見圖5。圖中節(jié)點(diǎn)的大小表示Degree值。外圈正六邊形52個(gè)為獨(dú)有活性成分，內(nèi)圈正六邊形4個(gè)為共有化學(xué)成分，箭形20個(gè)為選取P＜0.05的富集通路，菱形23個(gè)為共有靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得出各節(jié)點(diǎn)Degree值，前5的化學(xué)成分為槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（betasitosterol）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（stigmasterol）。

圖5 活性成分-靶點(diǎn)-富集通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 各組小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)期間，空白對(duì)照組小鼠飲食、大便、精神狀態(tài)等一般情況均未見明顯異常。模型對(duì)照組和給藥組小鼠均逐漸出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩、腹瀉、便血、食欲減退等不適。

3.6 各組小鼠相對(duì)體質(zhì)量比較 以D0時(shí)小鼠體質(zhì)量為基礎(chǔ)體質(zhì)量，相對(duì)體質(zhì)量=當(dāng)天測(cè)量體質(zhì)量（g）/基礎(chǔ)體質(zhì)量（g）×100。造模前各組小鼠體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模第5天時(shí)造模組小鼠相對(duì)體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.05），視為UC急性期模型造模成功?？瞻讓?duì)照組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)體質(zhì)量變化比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不存在時(shí)間效應(yīng)；模型對(duì)照組小鼠在造模開始后體質(zhì)量持續(xù)降低，于造模第10天達(dá)到最低值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥組小鼠在造模第7天前體質(zhì)量持續(xù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），造模第7天后體質(zhì)量逐漸上下波動(dòng)，存在時(shí)間效應(yīng)。各組小鼠相對(duì)體質(zhì)量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)；模型對(duì)照組小鼠在造模第5天后相對(duì)體質(zhì)量均低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；給藥組小鼠在造模第8天后相對(duì)體質(zhì)量均高于模型對(duì)照組（P＜0.05）；時(shí)間因素與分組因素存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表3、圖6）

表3 各組小鼠相對(duì)體質(zhì)量比較 （±s）

表3 各組小鼠相對(duì)體質(zhì)量比較 （±s）

注:F時(shí)間主效應(yīng)=30.395，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=36.388，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=7.224，P交互效應(yīng)=0.000；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.05

組別動(dòng)物數(shù)（只） D0D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10FP空白對(duì)照組10100±0.00 100.73±2.15 100.46±1.09 100.9±2.32 100.84±2.53 100.98±2.94 102.08±2.59 102.22±2.54 103.32±2.55 105.32±2.96 106.25±2.78 1.901 0.102模型對(duì)照組13100±0.00 102.52±1.45 102.23±1.21 101.41±1.54 100.99±1.82 95.89±2.01a 95.66±2.48a 90.71±3.61a 87.42±4.98a 83.67±4.89a 82.18±5.67a 26.331 0.000給藥組10100±0.00 103.01±1.48 101.41±2.76 101.32±2.14 101.12±1.71 96.35±2.60 95.57±2.0990.61±3.32 92.55±4.20b 90.78±6.00b 92.23±6.79b 25.445 0.000 F 5.0922.7490.2020.04713.45525.11944.42242.29258.44256.487 P 0.0120.0800.8180.9550.0000.0000.0000.0000.0000.000

圖6 體質(zhì)量交互效應(yīng)輪廓圖

3.7 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較 模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯短于空白對(duì)照組（P＜0.05），給藥組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于模型對(duì)照組（P＜0.05）。（見圖7）

圖7 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較 （±s）

3.8 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化情況 空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜、腺體及隱窩結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯，未見隱窩，存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；給藥組小鼠結(jié)腸黏膜腺體及隱窩結(jié)構(gòu)清晰，伴少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。（見圖8）

圖8 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織病理改變情況（HE，×40）

3.9 各組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；給藥組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）。（見圖9）

圖9 各組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

3.10 小鼠腸道菌群變化情況 本研究中18個(gè)糞便樣本被用于16S rDNA測(cè)序，群落組成分析在不同分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的物種豐度，通過群落柱形圖直觀反映群落組成。由圖10可知，門水平下小鼠腸道菌群集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteriota）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組變形菌門（0.05%→9.31%）、脫硫桿菌門（0.003%→2.72%）及梭桿菌門（0.00%→2.06%）豐度明顯降低（P＜0.01）；厚壁菌門（75.87%→55.46%）及疣微菌門（2.38%→0.14%）豐度明顯升高（P＜0.01）。潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后，給藥組小鼠腸道脫硫桿菌門（2.72%→1.51%）豐度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而變形菌門（9.31%→1.13%）、梭桿菌門（2.06%→0.03%）豐度較模型組明顯降低；給藥組厚壁菌門（55.46%→68.61%）豐度增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥組疣微菌門（0.14%→0.54%）豐度較模型組明顯增高（P＜0.05）。（見圖11～12）結(jié)果提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型腸道菌群結(jié)構(gòu)異常改變。

圖10 各組小鼠腸道菌群門水平表達(dá)水平

圖11 模型對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠腸道菌群門水平差異表達(dá)情況

圖12 模型對(duì)照組和給藥組小鼠腸道菌群門水平表達(dá)情況

與空白對(duì)照組比較，屬水平模型對(duì)照組小鼠腸道菌群中Clostridium_sensu_stricto_1（8.30%→22.33%）、Alistipe（s1.49%→16.81%）、擬桿菌屬（Bacteroides）（2.07%→10.94%）、大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）（0.003%→7.49%）、真桿菌屬（Eubacterium_fissicatena_group）（0.02%→3.27%）、Romboutsia（0.01%→2.10%）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）（0.003%→2.72%）、梭桿菌屬（Fusobacterium）（0%→2.06%）豐度明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；螺旋桿菌屬（Turicibacter）（19.13%→6.05%）、norank_f__Muribaculaceae（17.06%→0.2%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（13.87%→2.52%）、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014（8.56%→0.63%）、瘤胃球菌科未分類屬（unclassified_f__Ruminococcaceae）（5.98%→1.10%）、阿克曼菌屬（Akkermansia）（2.38%→0.14%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（1.75%→0.03%）豐度明顯降低（P＜0.01）。潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后，給藥組小鼠腸道大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）（7.49%→0.37%）、Fusobacterium（2.06%→0.03%）、UCG-005（0.52%→0.26%）、Clostridium_innocuum_group（0.47%→0.06%）、摩根氏菌屬（Morganella）（0.21%→0%）豐度明顯降低（P＜0.01）；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（2.52%→8.88%）、norank_f_Muribaculaceae（0.2%→3.47%）、瘤胃球菌科未分類屬（norank_f__Ruminococcaceae）（0.56%→1.57%）、Colidextribacter（0.41%→1.57%）、阿克曼菌屬（Akkermansia）（0.14%→0.54%）、毛螺菌科UCG-006屬（Lachnospiraceae_UCG-006）（0.09%→0.26%）、Anaeroplasma（0.02%→0.23%）、unclassified_c__Bacilli（0.05%→0.17%）、norank_f__norank_o_RF39（0.02%→0.18%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（0.03%→0.16%）豐度明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖13～15）結(jié)果提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ可能是通過增加益生菌乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、norank_f__Muribaculaceae、阿克曼菌屬（Akkermansia）豐度、降低致病菌大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）豐度發(fā)揮治療作用。

圖13 各組小鼠腸道菌群屬水平表達(dá)情況

圖14 空白對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠腸道菌群屬水平表達(dá)情況

圖15 模型對(duì)照組和給藥組小鼠腸道菌群屬水平表達(dá)情況

進(jìn)一步分析乳酸桿菌（Lactobacillus）、norank_f__Muribaculaceae、阿克曼菌屬（Akkermansia）、大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）等在小鼠腸道種水平變化情況，模型對(duì)照組小鼠uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae（17.06%→0.20%）、約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）（10.18%→1.30%）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri（2.01%→0.56%）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）（2.38%→0.14%）豐度明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），大腸桿菌（Escherichia_coli）（0.003%→7.49%）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）（0%→2.06%）豐度明顯升高（P＜0.01）。潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后，給藥組小鼠腸道大腸桿菌（Escherichia_coli）（7.49%→0.37%）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）（2.06%→0.03%）豐度明顯降低（P＜0.05），約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）（1.30%→5.27%）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）（0.56%→2.14%）、uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae（0.2%→3.47%）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）（0.14%→0.54%）豐度明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖16～17）

圖16 空白對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠腸道菌群種水平表達(dá)情況

圖17 模型對(duì)照組和給藥組小鼠腸道菌群種水平表達(dá)情況

3.11 小鼠腸道菌群與炎癥因子TNF-α、IL-1β相關(guān)性分析 小鼠腸道菌群在種水平uncultured_bacterium_g_norank_f__Muribaculaceae、約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）等益生菌豐度變化與TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）等致病菌豐度變化與TNF-αmRNA、IL-1β mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。（見圖18）結(jié)果提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ可能是通過增加益生菌uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae、約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）豐度、降低大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）豐度，從而抑制TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)來(lái)降低炎癥反應(yīng)。

圖18 小鼠腸道菌群與關(guān)鍵炎癥因子TNF-α、IL-1β相關(guān)性分析

4 討論

中醫(yī)學(xué)并無(wú)“潰瘍性結(jié)腸炎”的病名記載，但其諸多臨床癥狀如腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便可散見于中醫(yī)古籍“腸澼”“飧泄”“下利”“痢疾”等疾病的相關(guān)論述中。本課題組總結(jié)“丁氏中醫(yī)診療法”代表傳人丁澤民教授學(xué)術(shù)思想和丁義江教授臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為本病病位在大腸，表現(xiàn)為大腸“內(nèi)瘍”[25]。腸道是人體最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，健康個(gè)體的腸道菌群主要由擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門構(gòu)成，而環(huán)境、飲食及藥物等諸多因素都會(huì)引起腸道菌群的數(shù)量、種類、比例等一系列變化，造成腸道菌群失衡[26]。盡管腸道菌群失衡與UC發(fā)病因果關(guān)系尚無(wú)定論，但腸道菌群失衡是UC的顯著特征，主要體現(xiàn)在腸道菌群均度、豐度及多樣性的減少。

由于本病發(fā)病部位靠近體表，肛門最常受累，外用給藥方便，為中藥灌腸法提供了便利。中藥灌腸法在繼承中醫(yī)傳統(tǒng)外治法“導(dǎo)法”和中醫(yī)特色“辨證論治”思想的基礎(chǔ)上，憑借其簡(jiǎn)效廉及安全性高的特點(diǎn)而應(yīng)用廣泛[27-28]。自1963年施漢章首用《景岳全書》玉關(guān)丸保留灌腸治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎1例，此后中藥煎劑灌腸開始普遍用于治療本病。2017年《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識(shí)意見》肯定了中藥灌腸法治療UC的關(guān)鍵作用，并強(qiáng)調(diào)無(wú)論是直腸型、左半結(jié)腸型亦或廣泛結(jié)腸型UC均可采用中藥灌腸治療。

本研究顯示潰結(jié)灌腸液Ⅱ主要活性成分127個(gè)，改善UC菌群結(jié)構(gòu)及炎癥的關(guān)鍵活性成分中槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）為天然黃酮類化合物，β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）為植物甾醇類化合物。HONG Z等[29]實(shí)驗(yàn)表明槲皮素能通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠腸道厚壁菌門的異常減少及變形菌門的異常增加，來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。QU Y F等[30]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚能通過提高DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠腸道厚壁菌門與擬桿菌門的比例，重塑腸道菌群來(lái)抑制脂多糖誘導(dǎo)的TLR4-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，從而增加緊密蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的水平，恢復(fù)腸黏膜屏障的完整性。LI B L等[31]報(bào)告了木犀草素干預(yù)能增加UC大鼠腸道擬桿菌屬和芽孢桿菌屬豐度，顯著緩解結(jié)腸損傷，抑制炎癥反應(yīng)。經(jīng)木犀草素處理后，腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和組成也發(fā)生了改變。DING K等[32]指出β-谷甾醇能顯著上調(diào)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎腸上皮細(xì)胞多種抗菌肽的表達(dá)水平，這些抗菌肽又能夠有效抑制炎癥反應(yīng)及傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)，且該化合物具有低毒性特征。馮思敏等[33]比較了β-谷甾醇和豆甾醇對(duì)小鼠急性結(jié)腸炎的治療效果，發(fā)現(xiàn)豆甾醇在緩解癥狀、抑制炎癥方面效果優(yōu)于β-谷甾醇。

本研究中功能和通路富集分析提示腸道菌群失衡是UC免疫應(yīng)答異常的關(guān)鍵因素。富含微生物的腸道作為人體最大的內(nèi)分泌和免疫器官在應(yīng)激中起著重要的作用，尤其是氧化應(yīng)激反應(yīng)[34]。腸道菌群失調(diào)的相關(guān)疾病也往往與氧化應(yīng)激有關(guān)，腸道菌群的紊亂可能導(dǎo)致腸道活性氧自由基的過度生物利用，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[35-36]。在正常情況下，活性氧自由基具有殺菌作用，且參與腸道防御功能。但過量的活性氧自由基會(huì)打破機(jī)體調(diào)節(jié)氧化還原平衡的內(nèi)源性防御系統(tǒng)[37]。另外氧化應(yīng)激反應(yīng)還會(huì)觸發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成DNA的損傷及蛋白質(zhì)的異常表達(dá)，刺激促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，使結(jié)腸炎癥損傷不斷放大，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜損害，甚至致癌[38]?；钚匝踝杂苫€能夠促進(jìn)跨膜蛋白o(hù)ccludin的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)緊密連接的完整性，導(dǎo)致ZO-1的解離，增加腸黏膜屏障細(xì)胞旁通透性[39]。腸黏膜機(jī)械屏障的損傷使得腸道內(nèi)的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物脂多糖能以跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的方式或自由通過細(xì)胞間隙的方式越過腸黏膜屏障入侵黏膜固有層，造成細(xì)菌移位[40]。細(xì)菌移位激活黏膜固有層的中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)黏膜發(fā)生異常炎癥反應(yīng)，和UC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[41]。UC患者腸道有益共生菌的減少和機(jī)會(huì)致病菌的增多是菌群結(jié)構(gòu)失衡最典型的表現(xiàn)。先天免疫激活過程中，結(jié)腸上皮細(xì)胞與腸道黏膜中的細(xì)菌保持動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系?；诩?xì)菌抗原的快速識(shí)別Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）及NOD樣受體（NOD-like receptor,NLR），腸道中的細(xì)菌能刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞和腸道淋巴組織發(fā)生局部和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。在正常的腸道中，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞能對(duì)腸道共生菌進(jìn)行特異地識(shí)別并相互作用，從而維持著黏膜免疫的穩(wěn)態(tài)[42]。而募集于腸黏膜的淋巴細(xì)胞接受抗原刺激活化后分泌炎癥介質(zhì)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)；另一方面致病菌活躍也會(huì)被固有免疫細(xì)胞識(shí)別、吞噬，誘發(fā)效應(yīng)性T細(xì)胞過度增殖，如輔助性T淋巴細(xì)胞Th17導(dǎo)致UC腸道黏膜炎癥發(fā)生介導(dǎo)免疫損傷[43]。

通過對(duì)23個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，TNF、IL-1β等靶點(diǎn)是潰結(jié)灌腸液Ⅱ改善UC菌群結(jié)構(gòu)及炎癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TNF是巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在急性炎癥過程中產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子，參與炎癥、凋亡、淋巴細(xì)胞刺激和免疫細(xì)胞功能激活[44]。TNF可能通過活化NF-κB或AP-1轉(zhuǎn)錄因子來(lái)增強(qiáng)相關(guān)靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在炎癥部位的聚集增多，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞毒性、凋亡和急性期反應(yīng)等過程來(lái)介導(dǎo)腸黏膜損傷[45]。目前TNF抑制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于炎癥性腸病的治療，與傳統(tǒng)藥物相比取得了較好的治療效果[46]。IL-1β在UC受累黏膜中表達(dá)顯著高于未受累黏膜，且治療后IL-1β的含量明顯下降[47]。IL-1β在受累腸道能夠促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的抗原表達(dá)，吸引中性粒細(xì)胞，引起IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)釋放，使得炎癥細(xì)胞在受累腸道炎癥部位聚集[48-49]。為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，本研究采用DSS誘導(dǎo)構(gòu)建UC小鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠顯著改善小鼠體質(zhì)量減輕，減輕結(jié)腸長(zhǎng)度縮短，促進(jìn)腸黏膜愈合，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制腸黏膜IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)，提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ治療DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠療效顯著。

本研究通過16S rDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠腸道變形菌門、梭桿菌門及疣微菌門的異常改變，可能是通過增加益生菌約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊優(yōu)化桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌曼菌（Akkermansia muciniphila）、uncultured_bacter ium_g_norank_f__Muribaculaceae豐度，降低致病菌大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）豐度發(fā)揮治療作用。許多研究報(bào)告了UC患者和DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠腸道菌群厚壁菌門數(shù)量減少及變形菌門數(shù)量增加的現(xiàn)象，這與我們的研究結(jié)果是一致的[50-51]。疣微菌門是1987年首次被發(fā)現(xiàn)，至1997年才被劃出一門的新細(xì)菌；在人類腸道黏液層中，其代表菌為阿克曼菌科阿克曼菌屬阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）。Akk菌是疣微菌門的優(yōu)勢(shì)菌群，約占83%。進(jìn)一步分析種水平發(fā)現(xiàn)本研究中給藥組和模型對(duì)照組在門水平的顯著差異即是潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后小鼠腸道阿克曼菌增長(zhǎng)造成的，恰恰也是驗(yàn)證了這一點(diǎn)。QU S W等[52]研究發(fā)現(xiàn)阿克曼菌能夠通過激活NLRP3緩解DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎。乳桿菌屬在食物中廣泛分布，為一類能夠通過發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，包括100多個(gè)種和亞種，如羅伊氏乳桿菌、約氏乳桿菌等[53]。本研究中潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠顯著增加小鼠腸道種水平羅伊氏乳桿菌、約氏乳桿菌豐度，這與DONG L等[54]研究結(jié)果相同。伊氏乳桿菌及約氏乳桿菌能夠抑制促炎基因表達(dá)和恢復(fù)小鼠腸道微生物群，恢復(fù)緊密連接完整性，從而發(fā)揮抗炎作用[55-56]。KRISHNA M等[57]發(fā)現(xiàn)小鼠母體分娩前及哺乳期補(bǔ)充羅伊氏乳桿菌和約氏乳桿菌可改變小鼠腸道微生物群，并保護(hù)雌性后代免受實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的影響，為圍產(chǎn)期利用益生菌對(duì)抗UC的發(fā)展?jié)摿Φ於嘶A(chǔ)。Muribaculaceae在維持腸黏液層屏障功能中具有積極作用[58]。大腸桿菌屬志賀氏菌屬主要通過破壞腸黏膜通透性，增加出血發(fā)揮致病作用。本研究中DSS誘導(dǎo)UC小鼠模型腸道中大腸桿菌屬-志賀氏菌屬大腸桿菌豐度顯著增加。大腸桿菌能夠在易感宿主的腸道中長(zhǎng)期定殖，分泌α-溶血素促進(jìn)UC的發(fā)展，引發(fā)樹突狀細(xì)胞的死亡，刺激促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-23的表達(dá)，損傷緊密連接蛋白o(hù)ccludin，破壞Caco-2細(xì)胞中的緊密連接，增加屏障通透性[59]。梭桿菌屬定殖于人體口腔和腸黏膜，具有侵襲、黏附及促炎的致病特性，與UC及UC相關(guān)的結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[60]。DUBROVSKY A等[61]從熱帶地區(qū)患者潰瘍中分離出了梭桿菌屬潰瘍梭桿菌，本研究取得了和DUBROVSKY A等[61]類似的結(jié)果，潰瘍梭桿菌在UC患者腸道中顯著增加，而飲食干預(yù)或藥物干預(yù)能夠降低潰瘍梭桿菌豐度，提示潰瘍梭桿菌可作為治療UC的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，潰結(jié)灌腸液Ⅱ治療UC療效顯著，可能通過增加益生菌約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）、uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae豐度，減少致病菌大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）豐度，抑制TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)來(lái)降低腸道炎癥反應(yīng)。