侯紅平，王彩霞，彭 博，陳騰飛，趙曉曉，宋 玲，高云航，練東銀，李麗麗，張廣平

（1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700；2.河北御芝林生物科技有限公司，河北 石家莊 050000）

高脂血癥為臨床常見的慢性疾病，血清或血漿中的膽固醇大于5.18 mmol/L，甘油三酯大于2.26 mmol/L時，就可診斷為高脂血癥[1]。血脂異常往往伴隨著血壓、血糖的升高，是誘發(fā)心血管疾病的危險因素。目前，大量的研究表明，高脂血癥與多種慢性疾病的發(fā)生和進展密切相關(guān)，如骨質(zhì)疏松癥[2]、慢性腎病[3]等。為此，積極地預防和治療高脂血癥有著非常重要的臨床價值和社會意義。

臻通集膠囊由河北御芝林藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，主要成分包括三七粉、黃芪提取物、丹參提取物、銀杏葉提取物、葛根提取物、余甘子提取物、玉竹提取物，可以輔助降血脂、增強免疫力。本研究通過建立高脂血癥大鼠模型，探討臻通集膠囊對該模型大鼠的治療作用及其機制，以期為臻通集膠囊在高脂血癥的治療方面提供科學依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4～5周齡SPF級SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量70～90 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，大鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所SPF級屏障環(huán)境動物房。飼養(yǎng)條件：環(huán)境要求溫度為18～29 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%，12 h明/12 h暗。所有動物實驗操作均符合中國中醫(yī)科學院中藥研究所倫理委員會的規(guī)定，倫理批準號：2021B135。

1.2 藥物與試劑 臻通集膠囊（批號：202102010702）由河北御芝林藥業(yè)有限公司提供；阿托伐他汀鈣片（批號：EY1805）購自輝瑞制藥有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒（批號：01130C11）、膽固醇（cholesterol，CHO）試劑盒（批號：01126D11）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）試劑盒（批號：10222A11）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）試劑盒（批號：10223A11）、膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（批號：10124E11）均購自北京安圖生物工程有限公司；載脂蛋白B100（apolipoprotein B100，Apo-B100）ELISA試劑盒（批號：N16036068）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，Apo-A1）ELISA試劑盒（批號：N15036067）均購自華美生物工程有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒（批號：20211117）購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20220106）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒（批號：20210813）、乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶（acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferases，ACAT）ELISA試劑盒（批號：20220112）、3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme areductase，HMG-COA）ELISA試劑盒（批號：20220112）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 3-18KS型高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；TBA-120FR型全自動生化分析儀（日本佳能集團）；BSA3202S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.4 造模與分組 隨機取12只大鼠作為空白組，其余88只大鼠均為高脂血癥模型?？瞻捉M給予大鼠生長維持飼料，高脂血癥組大鼠給予專門的高脂飼料（混合型高脂血癥飼料配方：基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉[4]）喂養(yǎng)。連續(xù)4周后，剪尾采血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，全自動生化分析儀測定各組大鼠血清中TG、CHO，高脂血癥組大鼠TG和CHO明顯高于空白組（P＜0.05），視為造模成功。86只大鼠造模成功，造模成功率為97.7%（86/88）。造模結(jié)束后，取72只大鼠根據(jù)CHO測定值隨機分為模型組、西藥組、中西藥聯(lián)合組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組12只，雌雄各半。

1.5 實驗給藥 空白組大鼠正常喂食、飲水，其余各組大鼠正常飲水，給予專門的高脂飼料的同時灌胃給予藥物。阿托伐他汀鈣片的臨床開始用量為10 mg，1次/d，成人以70 kg為標準體質(zhì)量計算，大鼠的等效劑量為0.900 mg/kg，故西藥組大鼠灌胃給予阿托伐他汀鈣片溶液，0.900 mg/kg；臻通集膠囊（0.4g/粒）臨床用量為3粒/次，2次/d，大鼠的等效劑量為0.216g/kg。故中藥高、中、低劑量組大鼠分別灌胃給予臻通集膠囊溶液，0.432、0.216、0.108 g/kg；中西藥聯(lián)合組大鼠灌胃給予阿托伐他汀鈣片溶液（0.900 mg/kg）和臻通集膠囊溶液（0.216 g/kg），給藥體積10 mL/kg，空白組和模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥8周。實驗期間每周稱一次大鼠的體質(zhì)量，根據(jù)動物體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠一般情況觀察 實驗期間，每天給藥前和給藥后觀察大鼠的基本狀態(tài)，包括飲食情況、糞便、外觀及被毛、活動狀況等。

1.6.2 實驗取材 末次給藥后，大鼠禁食16 h，麻醉后腹主動脈采血，3 000 r/min離心15 min，取血清，進行后續(xù)指標的檢測。取肝臟，稱重后，部分肝臟凍存，進行后續(xù)指標的檢測；部分肝臟置于4%多聚甲醛中，進行HE病理染色觀察。

1.6.3 肝臟系數(shù) 根據(jù)肝臟質(zhì)量和動物體質(zhì)量，計算動物的肝臟系數(shù)。計算公式：肝臟系數(shù)（g/100 g）=肝臟質(zhì)量/動物體質(zhì)量×100。

1.6.4 血清血脂水平檢測 采用TBA-120FR型全自動生化分析儀檢測血清中的TG、CHO、HDL、LDL和TBA的含量，同時計算HDL/LDL（H/L）的比值。

1.6.5 血清中載脂蛋白的表達 嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中Apo-B100和Apo-A1的含量。

1.6.6 血清中氧化應激指標的表達 嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中MDA的含量，以及SOD和T-AOC的活性。

1.6.7 肝臟組織中膽固醇合成相關(guān)指標的表達 肝臟組織勻漿后，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測肝臟組織中的ACAT和HMG-COA的活性。

1.6.8 各組大鼠肝臟組織病理學檢測 固定后的肝臟組織，經(jīng)包埋、切片、脫蠟后進行蘇木素-伊紅染色，染色時間約5 min，封片后，通過顯微鏡觀察，采集圖像進行分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，多組比較采用單因素方差分析，方差齊時，兩兩比較方法使用最小顯著性差異法（LSD）進行檢驗，方差不齊時，選用Tamhane's T2法進行檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 空白組大鼠自主活動、精神狀態(tài)良好，反應敏捷，飲水、攝食及二便正常，毛色有光澤。模型組大鼠被毛暗淡無光澤，偶有干枯并伴有脫毛現(xiàn)象，行動遲緩，起初體質(zhì)量增加明顯，但造模2周后，大鼠出現(xiàn)飲食減少，體質(zhì)量持續(xù)波動的情況，分析認為與大鼠出現(xiàn)厭食情況有關(guān)，上述情況持續(xù)2～3周后有所緩解，體質(zhì)量持續(xù)均勻增加，排便量有所下降。西藥組、中西藥聯(lián)合組、中藥中劑量組、中藥高劑量組大鼠較模型組精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，活動量增大，體質(zhì)量增加較為緩慢。中藥低劑量組大鼠精神狀態(tài)與模型組無明顯的區(qū)別，體質(zhì)量增加明顯。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)比較 與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組、中西藥聯(lián)合組和中藥高劑量組大鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；中藥中劑量組大鼠肝臟系數(shù)明顯低于模型組（P＜0.01），而體質(zhì)量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中藥低劑量組大鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)比較 （±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

給藥劑量臻通集膠囊（g/kg）阿托伐他汀鈣片(mg/kg)空白組12--419.0±124.0 2.454±0.281模型組12--621.7±176.1a 3.593±0.397a西藥組12-0.900464.1±153.1b 2.655±0.245c中西藥聯(lián)合組 120.2160.900455.8±126.1b 2.550±0.257c中藥高劑量組 120.432-483.4±143.9b 2.782±0.305c中藥中劑量組 120.216-495.7±152.2 3.203±0.248c中藥低劑量組 120.108-499.8±145.2 3.459±0.418 F 6.4539.234 P 0.0000.000組別動物數(shù)（只）體質(zhì)量（g） 肝臟系數(shù)（g/100 g）

2.3 各組大鼠血清中血脂相關(guān)指標比較 與空白組比較，模型組大鼠CHO、TG、LDL、HDL含量均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），H/L明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、中西藥聯(lián)合組、中藥高劑量組、中藥中劑量組大鼠CHO、TG、LDL含量均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），H/L明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中西藥聯(lián)合組、中藥高劑量組大鼠HDL含量均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）；中藥低劑量組大鼠CHO、TG、LDL、HDL含量及H/L與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠間TBA含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清中血脂相關(guān)指標比較 （±s）

表2 各組大鼠血清中血脂相關(guān)指標比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

給藥劑量臻通集膠囊（g/kg） 阿托伐他汀鈣片（mg/kg）空白組12--0.49±0.132.02±0.500.90±0.200.43±0.1422.76±5.804.71±1.25模型組12--1.35±0.35b5.46±0.98b2.07±0.66a1.55±0.51b 43.84±35.83 0.49±0.14a西藥組12-0.9000.58±0.11d2.92±0.49d1.69±0.500.85±0.28d 24.92±13.64 1.33±0.40d中西藥聯(lián)合組 120.2160.9000.65±0.18d2.66±0.88d0.89±0.26c0.92±0.30d 20.28±9.731.41±0.45d中藥高劑量組 120.432-0.67±0.22d3.49±0.87d0.92±0.30c0.98±0.28c 24.47±9.801.80±0.41d中藥中劑量組 120.216-0.77±0.20c3.86±1.04c1.38±0.361.01±0.31c 31.89±17.21 1.18±0.37d中藥低劑量組 120.108-0.99±0.215.13±1.371.44±0.331.23±0.3333.45±11.63 0.93±0.22 F 6.6707.1955.8324.1942.61713.451 P 0.0000.0000.0000.0000.6230.000組別動物數(shù)（只）TG（mmol/L） CHO（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）TBA(μmol/L)H/L

2.4 各組大鼠血清中Apo-A1和Apo-B100含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清中Apo-A1、Apo-B100含量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中西藥聯(lián)合組、中藥高劑量大鼠血清中Apo-A1、Apo-B100含量均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），西藥組和中藥中劑量組大鼠血清中Apo-B100含量均明顯降低（P＜0.01）；中藥低劑量組大鼠血清中Apo-A1、Apo-B100含量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清中Apo-A1 和Apo-B100 含量比較（±s）

表3 各組大鼠血清中Apo-A1 和Apo-B100 含量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

給藥劑量臻通集膠囊（g/kg）阿托伐他汀鈣片（mg/kg）空白組12--747.96±157.172.29±0.48模型組12--4 051.58±1 198.85a 9.79±2.95a西藥組12-0.9002 205.41±669.672.43±0.52c中西藥聯(lián)合組 120.2160.9001 008.20±237.52b 2.76±0.54c中藥高劑量組 120.432-823.85±122.14c 2.15±0.56c中藥中劑量組 120.216-1 885.56±520.405.96±1.50c中藥低劑量組 120.108-3 320.06±899.78 11.72±3.28 F 8.69613.265 P 0.0000.000組別動物數(shù)（只）Apo-A1（ng/mL）Apo-B100（μg/mL）

2.5 各組大鼠血清中氧化應激指標比較 與空白組比較，模型組大鼠血清中MDA含量明顯升高（P＜0.01），而SOD、T-AOC活性均明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，中西藥聯(lián)合組、中藥中劑量組和中藥高劑量組大鼠血清中MDA含量均明顯降低（P＜0.01），而SOD、T-AOC活性均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；西藥組和中藥低劑量組大鼠血清中MDA含量及SOD、T-AOC活性與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠血清中氧化應激指標比較（±s）

表4 各組大鼠血清中氧化應激指標比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別動物數(shù)（只）MDA（nmol/mL） SOD（U/mL） T-AOC（mmol/L）給藥劑量臻通集膠囊（g/kg）阿托伐他汀鈣片（mg/kg）空白組12--24.48±8.15 308.91±92.071 170.44±13.39模型組12--155.93±50.58a 112.981±29.80a 39.20±12.87a西藥組12-0.900130.97±43.99 132.35±28.2034.67±11.34中西藥聯(lián)合組 120.2160.90031.25±9.92c 277.18±90.05c 102.96±17.54c中藥高劑量組 120.432-32.13±10.04c 237.84±13.02c 101.68±33.56c中藥中劑量組 120.216-54.74±18.07c 193.64±60.79b70.33±20.52b中藥低劑量組 120.108-84.99±28.05 164.86±12.2848.45±15.81 F 24.47514.77266.429 P 0.0000.0000.000

2.6 各組大鼠肝臟組織中膽固醇合成相關(guān)指標比較 與空白組比較，模型組大鼠肝臟組織中HMG-COA、ACAT含量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中西藥聯(lián)合組、中藥高劑量組大鼠肝臟組織中HMG-COA、ACAT含量均明顯降低（P＜0.05或者P＜0.01）；西藥組大鼠肝臟組織中HMG-COA含量明顯低于模型組（P＜0.01）；中藥中劑量組大鼠肝臟組織中ACAT含量明顯降低（P＜0.01）；中藥低劑量組大鼠肝臟組織中HMG-COA、ACAT含量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠肝臟組織中膽固醇合成相關(guān)指標比較（±s）

表5 各組大鼠肝臟組織中膽固醇合成相關(guān)指標比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）HMG-COA（ng/mg）ACAT（ng/mg）給藥劑量臻通集膠囊（g/kg）阿托伐他汀鈣片（mg/kg）空白組12--模型組12--西藥組12-0.900中西藥聯(lián)合組 120.2160.900中藥高劑量組 120.432-中藥中劑量組 120.216-中藥低劑量組 120.108-F 308.22±100.48 1 093.83±276.67a 505.32±118.29c 500.28±100.20c 763.66±186.94b 811.60±242.92 934.03±205.37 453.91±177.59 1 200.90±249.55a 1 366.96±340.27 430.51±181.77c 646.20±238.64c 630.21±200.99c 1 108.75±284.84 24.83327.710 P 0.0000.000

2.7 各組大鼠肝臟組織病理學變化情況 空白組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，細胞質(zhì)豐富，肝竇清晰可見；模型組大鼠肝臟組織出現(xiàn)脂肪變性，肝細胞胞漿出現(xiàn)脂滴，肝竇受壓，同時出現(xiàn)不同程度的炎癥細胞浸潤；西藥組大鼠肝臟組織排列整齊，大小形態(tài)正常；中西藥聯(lián)合組大鼠肝臟組織空泡明顯減少，腫脹得到緩解；中藥中、高劑量組大鼠肝細胞的損傷有所減輕，脂滴有所減少；與模型組比較，中藥低劑量組大鼠肝細胞和組織的改善不明顯，細胞腫大，明顯空泡化。（見圖1）

圖1 各組大鼠肝臟組織病理切片圖（HE，×200）

3 討論

目前，臨床上降脂的一線藥物多為化學藥物，一般分為三大類，即他汀類藥物、膽固醇吸收抑制劑類藥物和貝特類藥物。其中，他汀類藥物主要是通過抑制細胞內(nèi)膽固醇的合成來降低血脂，主要包括阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀等[5-6]。膽固醇吸收抑制劑類藥物主要是通過抑制血脂在腸道的吸收來降低血脂，主要為依折麥布[7-9]。貝特類藥物主要作用于甘油三酯的代謝，代表藥為氯貝丁酯[10]。上述藥物的作用靶點較為明確，療效顯著，但是長期應用對肝臟和腎臟有一定的損傷，從而限制臨床的長期應用[11]。中醫(yī)藥由于其多成分、多靶點、多效應的作用特點和優(yōu)勢，在血脂代謝異常方面的調(diào)控作用越來越突出。

在本研究中，SD大鼠在給予混合型高脂血癥飼料喂養(yǎng)4周后，TG和CHO均出現(xiàn)不同程度升高，證明造模成功。經(jīng)灌胃給藥8周后，阿托伐他汀鈣片能在一定程度上降低血清TG、CHO、LDL的表達，臻通集膠囊聯(lián)合阿托伐他汀鈣片能在一定程度上降低血清TG、CHO、LDL、HDL的表達，高、中劑量臻通集膠囊能在一定程度上降低血清TG、CHO、LDL、HDL的表達，提高H/L比值。在載脂蛋白方面，阿托伐他汀鈣片僅能降低Apo-B100的表達，臻通集膠囊聯(lián)合阿托伐他汀鈣片、高劑量臻通集膠囊均能一定程度降低Apo-A1和Apo-B100的表達。而在抗氧化應激方面，臻通集膠囊表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢。阿托伐他汀鈣片對HMG-COA的活性具有抑制作用，而對膽固醇脂化酶ACAT的活性無影響，這與他汀類藥物主要通過抑制細胞內(nèi)膽固醇合成來降低血脂相一致。而臻通集膠囊對ACAT和HMG-COA的表達均有一定的抑制作用。

臻通集膠囊的降脂作用與其成分的作用特點密不可分。研究表明，丹參總酚酸具有降血脂和抗氧化的作用[12]。葛根多糖、葛根素、葛根總黃酮均有降低血脂的作用，與其能夠降低血清炎癥因子水平、抑制MAPK信號通路激活、改善血凝系統(tǒng)、降低血黏度、提高抗氧化能力等密切相關(guān)[13-15]。黃芪甲苷作為黃芪的主要藥效成分，具有降脂、改善抗氧化酶活性、抑制氧化應激損傷的作用[16]。同時，黃芪多糖可降低高脂血癥大鼠的血脂，減少肝臟脂質(zhì)沉積，提高肝臟和血液的抗氧化能力，減輕高脂飲食導致的氧化損傷[17]。銀杏葉提取物具有降低血脂的作用，與其抑制脂質(zhì)過氧化[18]、促進腸道有益菌生長繁殖[19]、調(diào)整脂蛋白-膽固醇代謝、糾正自由基代謝紊亂、增強抗氧化酶活性等作用密切相關(guān)[20]。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，余甘子有多種藥理作用，如抗氧化、降血脂、降血糖、降血壓等[21]。玉竹多糖具有較好的調(diào)節(jié)糖脂作用，并可抑制小鼠肥胖的形成[22]。

綜上，臻通集膠囊能夠降低高脂血癥大鼠的血脂水平，與其抗氧化、抑制膽固醇合成等作用密切相關(guān)。