吳智恒，吳睿哲，榮 尚，馬文元，孫紹裘

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

股骨頭壞死（femoral head necrosis）為骨科、傷科的臨床難治病，有著早期病情隱匿、臨床進(jìn)展快等特點。目前該病的治療案例更多為侵入性治療，這與以保髖為優(yōu)先的臨床倡導(dǎo)不適應(yīng)，也不滿足多數(shù)病患的社會生活及心理需求。該現(xiàn)狀也向股骨頭壞死的早期防治提出挑戰(zhàn)。在尚缺乏特效藥的情況下，近年國內(nèi)臨床診療指南提出了防治以保護(hù)血運、改善應(yīng)力以延緩骨壞死程度等為目標(biāo)，并倡導(dǎo)在早中期及功能需求高的患者人群中結(jié)合中醫(yī)藥的“活血化瘀”治法[1]。桃紅四物湯作為“活血化瘀”法的經(jīng)典方，在中醫(yī)骨傷科疾病中的臨床應(yīng)用廣泛，常用于股骨頭壞死的防治。股骨頭壞死的修復(fù)期，細(xì)胞成骨化對新骨再生十分重要[2-3]。經(jīng)典的研究在生長因子對骨組織細(xì)胞成骨化的調(diào)節(jié)方面已有深刻認(rèn)識[4-5]。近期研究提示，BMP/Smads/Runx2信號通路為間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的重要通路，并對骨組織細(xì)胞損傷有保護(hù)及修復(fù)意義[6-7]。而該信號通路的調(diào)控對治療創(chuàng)傷性股骨頭壞死的影響及桃紅四物湯治療股骨頭壞死的具體機(jī)制尚待研究。創(chuàng)傷性股骨頭壞死（traumatic osteonecrosis of the femoralhead，TONFH）是股骨頭壞死的一大臨床分型，該病病因相對確定（明顯的創(chuàng)傷史），因此該類型早診、早治療較非創(chuàng)傷性股骨頭壞死有利，疾病模型更單純，基于這類模型的研究對股骨頭壞死的早期診療和防治有較高參考價值。本實驗通過手術(shù)模擬創(chuàng)傷建立創(chuàng)傷性股骨頭壞死大鼠模型，用桃紅四物湯口服湯劑進(jìn)行干預(yù)對比，觀察模型大鼠股骨頭病理組織形態(tài)變化并觀測骨組織BMP2、Smad1/5/8、Runx2的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討桃紅四物湯治療創(chuàng)傷性股骨頭壞死的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12周齡SPF級SD雄性大鼠35只，體質(zhì)量250～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：430727211100405535。實驗單位使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009。大鼠在實驗室動物飼養(yǎng)間適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。飼養(yǎng)條件：所有實驗大鼠在同一屏障系統(tǒng)同一飼舍內(nèi)分籠飼養(yǎng)，溫度保持在20～25 ℃，濕度控制在40%～70%，每12 h交替開關(guān)飼舍內(nèi)燈光模擬晝夜變化，空氣由實驗室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)消殺過濾，提供標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料及蒸餾水，每日定時定量進(jìn)行2次投喂，保持飼舍、飼籠清潔。實驗中需取材或結(jié)束實驗時，大鼠均采用過量麻醉法處死。實驗大鼠涉及喂養(yǎng)、處置方式經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗福利倫理審查，倫理審查批準(zhǔn)編號：LL2021031002。

1.2 藥物與試劑 桃紅四物湯，方藥組成：生地黃20 g，當(dāng)歸20 g，赤芍20 g，川芎10 g，桃仁20 g，紅花10 g。上述中藥材超微顆粒劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供。BMP2兔抗體（批號：18933-1-AP）、Smad1兔抗體（批號：10429-1-AP）、HRP goat anti-mouse IgG（批號：SA00001-1）、HRP goat anti-rabbit IgG（批號：SA00001-2）均購于美國proteintech公司；Smad5兔抗體（批號：bs-13890R）、Smad8兔抗體（批號：bs-8844R）、Runx2兔抗體（批號：bs-1134R）均購于博奧森公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2569）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2141）均購于北京康為世紀(jì)公司；蘇木素-伊紅染色試劑盒（批號：20210918）、Masson染色試劑盒（批號：20210918）均購于Wellbio公司。

1.3 主要儀器 TS-型1搖床、GL-88B型旋渦混合器（江蘇其林貝爾公司）；H1650R型臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀公司）；PIKOREAL96型熒光定量RCP儀、SPL0960型熒光PCR板（美國Thermo公司）；DYY-2C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀、DYCP-31DN型水平瓊脂糖電泳槽（北京六一股份有限公司）；JB-13型磁力攪拌器、PHS-3C型精密PH計（雷磁科技股份有限公司）；JJ224BC型電子天平（美國雙杰股份有限公司）；BioPrep-24型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛科技公司）；M199型切片刀（萊卡技術(shù)股份有限公司）；YD-315型切片機(jī)（浙江金華益迪公司）；BMJ-A型包埋機(jī)（常州中威電子儀器股份有限公司）；BA210T型顯微鏡（Motic公司）。

1.4 造模與分組 35只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用完全隨機(jī)分組法分成空白組、模型組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯中劑量組、桃紅四物湯高劑量組。除空白組外，其余4組大鼠參考經(jīng)典股骨頭血供剝離法造模[8]。具體操作：術(shù)前禁水、禁食12 h，腹腔麻醉大鼠，取俯臥位，由臀部背側(cè)入路，切開皮膚、皮下組織及臀肌，定位在轉(zhuǎn)子部不斷分離軟組織及韌帶至髖關(guān)節(jié)囊，切斷圓韌帶并脫離股骨頭，盡量剝離周圍肌肉組織并剪出部分軟組織，復(fù)位后清洗術(shù)口并逐層縫合。術(shù)后3 d內(nèi)給予青霉素（5萬U/d）肌內(nèi)注射預(yù)防感染。造模過程中無大鼠死亡。造模后自然喂養(yǎng)4周。以大體形態(tài)學(xué)方法檢驗造模是否成功[9]，即每組隨機(jī)各抽取1只大鼠，用過量稀釋水合氯醛麻醉處死，取術(shù)側(cè)股骨頭樣本進(jìn)行標(biāo)本大體形態(tài)觀察，若見股骨頭關(guān)節(jié)軟骨表面色澤暗淡無光澤，表面欠平整，股骨頭結(jié)構(gòu)扁平化、變形和塌陷甚至頭頸分離，可證明造模成功。手術(shù)過程情況見圖1，檢驗造模成功情況見圖2。

圖1 股骨頭造模手術(shù)過程示意圖

圖2 抽取驗證造模情況的股骨頭大體觀察

1.5 實驗給藥 根據(jù)人與動物用藥劑量換算[9]，D鼠=D人×R鼠/R人（D為給藥劑量，R為動物與人體表面積比值系數(shù)的查表數(shù)值）計算桃紅四物湯給藥劑量，得出280 g體質(zhì)量大鼠給藥量約為2.5 g（8.9 g/kg），以此標(biāo)準(zhǔn)作為桃紅四物湯中劑量組給藥量，結(jié)合飼養(yǎng)中大鼠體質(zhì)量增長變化情況，分組劑量按照2倍方式遞增，將桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠分別以4.4、8.9、17.8 g/kg給藥，2次/d。空白組及模型組大鼠則灌服等體積生理鹽水，2次/d，自然喂養(yǎng)，連續(xù)給藥6周。

1.6 觀察指標(biāo) 干預(yù)6周后，所有大鼠進(jìn)行股骨頭取材。過量稀釋水合氯醛麻醉處死大鼠后，同造模時入路，顯露股骨周圍肌肉組織后逐步剝離髖關(guān)節(jié)端及股骨下端直至股骨離體，清除骨面殘余軟組織。從中部將股骨橫斷，其中近股骨頭段取切片進(jìn)行HE染色及Masson染色觀察骨組織病理形態(tài)；股骨下端部分組織在-80 ℃條件下冰凍保存，用于骨組織蛋白質(zhì)及mRNA檢測。

1.6.1 觀察骨組織病理形態(tài)及計算空骨陷窩率 股骨頭端骨浸入4%多聚甲醛通用型固定液固定1周后，進(jìn)行常規(guī)脫鈣后石蠟固定，切片后，以60 ℃烤片12 h，使用二甲苯用乙醇脫蠟、染色（分別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色和Masson試劑染色），最后用梯度酒精脫水，封存成片。光鏡下觀察HE染色骨組織切片，主要觀察骨細(xì)胞、骨髓內(nèi)造血組織、骨小梁形態(tài)、脂肪組織情況，再對每張切片光鏡×200視野下隨機(jī)抽取5個區(qū)域，計數(shù)空骨陷窩數(shù)[10]，計算5張隨機(jī)視野的平均空骨陷窩率?？展窍莞C率=（空骨陷窩數(shù)/50）×100%。光鏡下觀察Masson染色骨組織切片，觀察骨組織及周圍組織的肌肉組織情況和纖維組織情況。肌纖維組織染色呈紅色，膠原纖維組織染色呈藍(lán)色。計算機(jī)測算IOD/Area值代表膠原纖維圖像占比。

1.6.2 RT-PCR檢測骨組織BMP2 mRNA、Smad1/5/8 mRNA、Runx2 mRNA表達(dá)水平 Trizol提取骨組織總RNA，紫外分光光度計測定濃度；以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA；SYBR法加入對應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終反應(yīng)體系為30 μL，確定擴(kuò)增條件為95 ℃，并進(jìn)行10 min的預(yù)變性，在95 ℃條件下變性15 s，在60 ℃條件下退火30 s，如此循環(huán)40次，充分延展后電泳成像，掃描定量。各指標(biāo)的引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.6.3 Western blotting測定骨組織BMP2、Smad1/5/8、Runx2蛋白表達(dá)水平 剪取骨組織，預(yù)冷PBS清洗骨組織，加入350 μL RIPA裂解液研磨，冰上、裂解后移至離心管內(nèi)，預(yù)冷離心機(jī)以12 000 r/min離心15 min，經(jīng)TEMED制膠。取200 μL蛋白上清，加入50 μL 5×loading buffer混勻、煮沸、速冷，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，以75 V電壓行凝膠電泳分離130 min，濕法轉(zhuǎn)膜，PBST配制5%脫脂奶粉靜置低溫過夜封閉，混合工作濃度1∶500的兔抗大鼠BMP2一抗轉(zhuǎn)膜60 min，1∶1 000的兔抗大鼠Smad1/5/8一抗70 min、1∶1 000的兔抗大鼠Runx2一抗90 min，加入PBST 1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育90 min，ECL發(fā)光，暗盒顯影，以Quantity One系統(tǒng)分析蛋白條帶并獲取并分析其灰度。以目標(biāo)條帶灰度值和內(nèi)參蛋白灰度值比值代表蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以（±s）表示，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性、方差齊性，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；不滿足方差齊性，則采用Games-Howell法比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨頭病理形態(tài)學(xué)描述 HE染色顯示，空白組大鼠股骨頭鈣化組織嚴(yán)密，骨小梁排列整齊，骨小梁中散在一定量的含紅細(xì)胞、造血細(xì)胞組織，骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞飽滿，細(xì)胞核清晰，脂肪細(xì)胞少；模型組大鼠股骨頭鈣化組織比例低，骨小梁松散，排列無規(guī)則，造血細(xì)胞少，骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞欠飽滿，脂肪細(xì)胞比例高；桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠骨小梁組織多且排列緊密，造血細(xì)胞豐富，骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞少于空白組，而多于模型組，脂肪細(xì)胞比例多于空白組，少于模型組，骨小梁內(nèi)造血細(xì)胞含量較多。Masson染色顯示，在大鼠股骨頭肌纖維比例比較中，空白組大鼠股骨頭肌纖維分布更加緊密連貫，模型組大鼠肌纖維含量比例低于空白組，桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠肌纖維含量比例高于模型組；在大鼠股骨頭膠原纖維比例比較中，空白組大鼠膠原纖維比例最低，模型組大鼠膠原纖維比例高于空白組，桃紅四物湯高、中、低劑量組大鼠膠原纖維比例均低于模型組，桃紅四物湯中、高劑量組大鼠膠原纖維比例均低于桃紅四物湯低劑量組，桃紅四物湯中劑量組與桃紅四物湯低劑量組膠原纖維比例差異不明顯。（見圖3～4）

圖3 各組大鼠股骨頭切片標(biāo)本HE 染色情況 （×200）

2.2 各組大鼠股骨頭空骨陷窩率、IOD/Area比值比較 與空白組比較，模型組大鼠股骨頭空骨陷窩率、IOD/Area比值均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅四物湯低劑量組大鼠股骨頭空骨陷窩率、IOD/Area比值均明顯升高（P＜0.05），桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨頭空骨陷窩率、IOD/Area比值均明顯降低（P＜0.05）；桃紅四物湯中劑量組大鼠股骨頭空骨陷窩率明顯低于模型組（P＜0.05），IOD/Area比值明顯高于模型組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨頭空骨陷窩率、IOD/Area比值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖5、表2）

表2 各組大鼠股骨頭空骨陷窩率及IOD/Area比值比較 （±s）

表2 各組大鼠股骨頭空骨陷窩率及IOD/Area比值比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與桃紅四物湯中劑量組比較，dP＜0.05

組別動物數(shù)（只） 給藥劑量（g/kg） 空骨陷窩率（%） IOD/Area空白組6-21.06±4.150.07±0.00模型組6-44.18±2.24a0.11±0.01a桃紅四物湯低劑量組 64.452.00±8.57b0.17±0.04b桃紅四物湯中劑量組 68.934.11±6.40bc0.13±0.02bc桃紅四物湯高劑量組 617.821.10±4.83bcd0.07±0.01bcd F 34.45315.976 P 0.0000.000

圖4 各組大鼠股骨頭切片標(biāo)本Masson 染色情況 （×200）

圖5 各組大鼠股骨頭空骨陷窩情況 （×200）

2.3 各組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），且桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于桃紅四物湯中劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯中劑量組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中BMP2 mRNA、Smad1 mRNA、Smad5 mRNA、Smad8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與桃紅四物湯中劑量組比較，dP＜0.05

組別動物數(shù)（只） 給藥劑量（g/kg） BMP2 mRNA Smad1 mRNA Smad5 mRNA Smad8 mRNA Runx2 mRNA空白組6-1.13±0.081.10±0.081.09±0.071.09±0.081.28±0.17模型組6-0.06±0.01a0.13±0.02a0.12±0.04a0.09±0.03a0.08±0.03a桃紅四物湯低劑量組 64.40.23±0.04b0.35±0.07b0.24±0.07b0.34±0.09b0.27±0.09b桃紅四物湯中劑量組 68.90.36±0.02bc0.42±0.08bc0.48±0.11bc0.43±0.09bc0.35±0.02bc桃紅四物湯高劑量組 617.80.79±0.10bcd0.75±0.11bcd0.70±0.12bcd0.63±0.04bcd0.61±0.13bcd F 266.962131.744106.152138.901109.017 P 0.0000.0000.0000.0000.000

2.4 各組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2蛋白相對表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），且桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于桃紅四物湯中劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯中劑量組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中的BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）。（見表4、圖6）

表4 各組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表4 各組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與桃紅四物湯中劑量組比較，dP＜0.05

組別動物數(shù)（只） 給藥劑量（g/kg） BMP2Smad1Smad5Smad8Runx2空白組6-0.51±0.070.49±0.030.56±0.110.55±0.180.60±0.11模型組6-0.11±0.02a0.24±0.07a0.27±0.04a0.24±0.04a0.14±0.06a桃紅四物湯低劑量組64.40.19±0.05b0.37±0.08b0.30±0.05b0.28±0.06b0.21±0.01b桃紅四物湯中劑量組68.90.30±0.04bc 0.41±0.16bc0.39±0.09bc0.41±0.05bc0.37±0.06bc桃紅四物湯高劑量組617.80.41±0.05bcd 0.49±0.13bcd0.55±0.07bcd0.59±0.13bcd 0.50±0.12bcd F 53.1135.33517.42111.64828.910 P 0.0000.0000.0000.0000.000

圖6 各組大鼠股骨頭局部組織細(xì)胞中BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Runx2 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

3 討論

創(chuàng)傷性股骨頭壞死本質(zhì)為一種股骨頭的缺血性壞死[11]，是常見于骨折后因外力因素造成股骨頭血液供應(yīng)被直接破壞進(jìn)而引起的嚴(yán)重并發(fā)癥。外傷致股骨頸/頭骨折常為其原發(fā)疾病。損傷部位可伴隨著急慢性骨關(guān)節(jié)炎[12]、骨細(xì)胞缺乏正常營養(yǎng)等，且骨組織的修復(fù)能力相對低下時，該疾病的一般病程表現(xiàn)為股骨頭部發(fā)生骨細(xì)胞的變性、壞死，骨小梁結(jié)構(gòu)改變，最終可出現(xiàn)骨組織塌陷[13]，從而影響髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能。中醫(yī)學(xué)中多把股骨頭壞死認(rèn)定為以“血瘀”為主的傷科疾病，且在病程的早中期以“活血化瘀”為基本治法。桃紅四物湯為清代吳謙所著《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》中收載的活血化瘀之要方，后世以其活血化瘀兼補(bǔ)血養(yǎng)血的方義而廣泛應(yīng)用于骨傷疾病。其配伍精當(dāng)，活血而不留瘀，對于骨折病、下肢血栓、股骨頭壞死等骨科疾病有明確療效[14]，同時對骨科術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)也有緩解作用[15]?？邓刮牡萚16]研究發(fā)現(xiàn)，在運用保髖手術(shù)的基礎(chǔ)上使用該方能顯著提高股骨頭壞死患者血清骨堿性磷酸酶水平，降低骨鈣素水平，并能促進(jìn)髖關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)。姚金龍等[17]以患者疼痛癥狀和髖關(guān)節(jié)活動度評價桃紅四物湯治療股骨頭壞死的療效，結(jié)果表明桃紅四物湯在改善臨床癥狀方面療效肯定。

成骨本身即是血管系統(tǒng)和間葉細(xì)胞成骨分化的共同結(jié)果。徐世紅等[18]使用桃紅四物湯含藥血清干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，與對照組比較，發(fā)現(xiàn)ALP表達(dá)上調(diào)，同時細(xì)胞群組吸光度的提升證明了該方對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖影響。一些對桃紅四物湯單藥的藥理研究實驗證明了川芎嗪、當(dāng)歸多糖、赤芍總苷等單藥成分是促進(jìn)骨細(xì)胞再生、骨髓內(nèi)造血細(xì)胞增生和血管內(nèi)皮重構(gòu)、抑制炎癥因子及抗凝血、抗血栓形成的有效成分[19-23]。這為探討桃紅四物湯治療骨損傷和骨壞死疾病的機(jī)制提供了研究方向。

成骨化蛋白信號層面的研究已開展多年。早期就有研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、Smads是經(jīng)典的成骨信號蛋白因子。BMP是一種多功能的細(xì)胞生長因子，它在骨形成、修復(fù)、再生中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[24]。其亞型BMP2在促進(jìn)骨形成和成骨分化中較活躍。BMP2在骨細(xì)胞分化過程中是重要的細(xì)胞外信號[25]，可結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞膜上的兩種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體向胞內(nèi)傳達(dá)成骨、成軟骨等誘導(dǎo)信號[26-27]。Smads是BMP胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的介導(dǎo)蛋白，分為受體調(diào)節(jié)型Smads（R-Smads）、共同中間型Smads（Co-Smads）、抑制性Smads（I-Smads）三大類。亞型中Smad1/5/8都是受體調(diào)節(jié)型，可與Co-Smads形成異源復(fù)合物后將胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞核[28]。近年研究發(fā)現(xiàn)BMP-Smads通路的成骨信號在胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)有諸多因子的參與。其中Runx2又稱核結(jié)合因子（core-binding factor subunit alpha-1，Cbfα1），為重要的成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，其向上表達(dá)受到BMP對Smad1/5/8通路的調(diào)節(jié)，使成骨化信號發(fā)生不可逆調(diào)整[29]。

近年來，研究者對BMP2/Smads/Runx2成骨化信號通路的成骨化機(jī)制展開了探究。一些實驗著眼于該信號通路對細(xì)胞內(nèi)外的經(jīng)典細(xì)胞因子的調(diào)控。離體實驗[30-33]證明BMP2、Smad1/5、Runx2的表達(dá)上調(diào)對成骨細(xì)胞因子ALP、CollagenⅠ、骨鈣素、BGP、OPN有上調(diào)作用。田照[34]研究認(rèn)為BMP2/Smads/Runx2-Osterix成骨分化通路中，Runx2和Osterix有時序性差異。也有研究揭示了BMP2/Smads/Runx2通路在骨及骨組織損傷的保護(hù)作用對成骨化起到了協(xié)同作用，如骨質(zhì)疏松癥所致的骨量丟失是成骨破骨平衡破壞的常見結(jié)果。骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)研究[35-37]發(fā)現(xiàn)，BMP2/Smads/Runx2通路信號上調(diào)，有利于抗骨量丟失和骨組織形成，從而提高骨密度。有研究顯示骨損傷的保護(hù)和BMP2/Smad1/Runx2通路上調(diào)與超氧化物歧化酶、丙二醛水平降低有關(guān)[38]。上述研究證明BMP2/Smads/Runx2信號通路可通過調(diào)節(jié)成骨信號表達(dá)、抗骨量丟失和緩解骨組織損傷等多個方面促進(jìn)成骨化。

與空白組比較，模型組大鼠于大體觀察和骨組織病理切片中均存在明顯的骨與鈣質(zhì)的丟失，空骨陷窩率高，骨小梁結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，骨質(zhì)含量低，造血細(xì)胞含量少，抗組織膠原纖維化能力差，骨組織細(xì)胞中BMP2 mRNA、Smad1/5/8 mRNA、Runx2 mRNA相對表達(dá)量低，骨組織細(xì)胞中BMP2、Smad1/5/8、Runx2蛋白表達(dá)量低；與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)、骨質(zhì)含量、造血細(xì)胞等方面有不同程度改善，骨組織細(xì)胞中BMP2、Smad1/5/8、Runx2的蛋白表達(dá)及mRNA相對表達(dá)量均明顯升高；桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨頭空骨陷窩率、IOD/Area比值均明顯低于模型組。本研究結(jié)果結(jié)合他人研究和論述顯示，上述信號因子之間在間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中有連貫的、促進(jìn)性的通路關(guān)系，但無法證明該通路的成骨作用的優(yōu)勢性。桃紅四物湯低、中、高劑量組中各個因子在組織及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的差異提示該信號通路的表達(dá)上調(diào)程度與桃紅四物湯藥物劑量可能呈正相關(guān)關(guān)系。桃紅四物湯能改善股骨頭損傷表現(xiàn)和延緩股骨頭壞死進(jìn)程的病理學(xué)表現(xiàn)，且各組空骨陷窩率的差異比較中呈現(xiàn)出對較高劑量的依賴性，但當(dāng)前的實驗無法確定桃紅四物湯與治療股骨頭壞死病情的有效血藥濃度范圍，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及進(jìn)行藥理實驗。Masson染色顯示的骨組織切片中膠原纖維比例變化有差異性，可以提示桃紅四物湯可能影響了膠原纖維對損傷后的骨組織的填充情況，但未呈現(xiàn)明確量效關(guān)系，仍需進(jìn)一步實驗證明。

綜上所述，桃紅四物湯可以改善創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型大鼠股骨頭的病理表現(xiàn)，可能與通過活化BMP2/Smads/Runx2通路，提高股骨頭損傷局部骨組織的成骨化表達(dá)有關(guān)。