張森鵬 何子煜 全 明 葉爾柏 楊澤純 李 淇 周玉其 杜以寬 楊 春

（廣東醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與再生組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種具有侵襲性的血液學(xué)惡性B細(xì)胞瘤，其特征是惡性漿細(xì)胞（plasma cell，PC）在骨髓內(nèi)聚集、分裂生長(zhǎng)及骨髓源性干細(xì)胞（marrow-derived stem cells，MSC）的成骨細(xì)胞分化受損［1-4］。研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者中脂肪干細(xì)胞（adipose stem cells from patients with multiple myeloma，MM-ASC）的CD200過(guò)表達(dá)明顯，提示MM患者病理過(guò)程中全身性免疫處于抑制狀態(tài)［5］。與正常健康供體脂肪干細(xì)胞（adipose stem cells from healthy donors，HD-ASC）相比，MM-ASC不僅會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的生長(zhǎng)因子（如IL-6），也會(huì)過(guò)度分泌生長(zhǎng)和分化因子15（GDF15）［6］。表明MM-ASC與HD-ASC在分子表達(dá)上存在差異，而探討二者間的差異可能發(fā)現(xiàn)MM發(fā)生、發(fā)展的潛在機(jī)制。因此，本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取MM患者和正常人脂肪干細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)R語(yǔ)言篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），隨后進(jìn)行基因本體論（GO）分析、構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)（PPI）等，從中挖掘出CDH2、CD44、CXCL12等DEGs，找到NF-κB信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等關(guān)鍵信號(hào)通路，分析預(yù)測(cè)關(guān)鍵miRNAs如miR-30a-3p、miR-30d、miR-34a，研究ASC調(diào)控MM的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為MM的早期信號(hào)通路干預(yù)及其靶向治療提供方向。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO DataSets數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）中檢索MM和ASC的相關(guān)數(shù)據(jù)集，綜合考慮樣本數(shù)量、信息完整度和可靠性，最終篩選出GSE133346芯片數(shù)據(jù)，其中包含12例MM-ASC與12例HD-ASC樣本。該數(shù)據(jù)集采用GPL570平臺(tái)（Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）。

1.2 DEGs的 篩 選R3.5.0中Bioconductor的“affy”包可對(duì)CEL原始文件進(jìn)行基因表達(dá)歸一化和相關(guān)背景校正的預(yù)處理。通過(guò)R語(yǔ)言軟件編程、分析，設(shè)定篩選表達(dá)差異值P＜0.05、|log2FC|＞1的基因作為DEGs。篩選出的DEGs利用R3.5.0中的plot包繪制火山圖，heatmap.2包繪制熱圖。

1.3 DEGs進(jìn)行GO分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析GO分析是基因功能富集研究的常用方法，本研究以DAVID6.8在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)DEGs進(jìn)行GO分析；同時(shí)利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行生物通路富集分析。所得結(jié)果運(yùn)用R語(yǔ)言ggplot2包繪制氣泡圖。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)浜Y選Hubgene String（https：//string-db.org/）是利用已知或預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫(kù)。利用String構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選條件設(shè)為interaction score＞0.4。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行可視化，并進(jìn)一步采用Cytoscape3.7.2中的Cyto-hubba插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)自由度（degree），degree≥1的節(jié)點(diǎn)即為關(guān)鍵DEGs，并根據(jù)自由度大小調(diào)整圖像。

1.5 靶基因的預(yù)測(cè)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分別利用TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）和miRDB（http：//www.mirdb.org）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GSE133346數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。利用Venny生成交集基因，將其作為靶基因。再將預(yù)測(cè)的靶基因與GSE133346差異表達(dá)的mRNAs取交集，整理出miRNA-mRNA關(guān)系對(duì)，最后用Cytoscape3.7.2構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選結(jié)果GSE133346數(shù)據(jù)集中MMASC和HD-ASC存在123個(gè)DEGs，其中有上調(diào)基因36個(gè)，下調(diào)基因87個(gè)。結(jié)果采用R語(yǔ)言“gplot”包繪制DEGs的火山圖，見(jiàn)圖1；采用heatmap.2包繪制DEGs的熱圖，見(jiàn)圖2。

圖1 DEGs的火山圖Fig.1 Volcano plot of DEGs

圖2 DEGs的熱圖Fig.2 Heat map of DEGs

2.2 DEGs的富集分析和功能注釋通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO分析包括對(duì)DEGs的生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）三方面進(jìn)行富集分析。GO分析顯示，BP變化主要包括生物體發(fā)育、經(jīng)典Wnt信號(hào)通路、鈣化過(guò)程、激素的生物合成過(guò)程等，見(jiàn)圖3A；MF變化主要包括血小板衍生生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、3'5'環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶的活動(dòng)、金屬內(nèi)肽酶、鈣調(diào)素結(jié)合、血液循環(huán)等6種功能，見(jiàn)圖3B；CC變化主要包括膠原蛋白三聚體、膜的錨定組分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、板狀偽足、細(xì)胞外基質(zhì)等12種細(xì)胞組分，見(jiàn)圖3C。根據(jù)P值大小，在GO詞條中，BP、MF、CC富集最豐富的分別是生物體發(fā)育、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、質(zhì)膜。此外，信號(hào)通路分析結(jié)果顯示這些DEGs共參與6條信號(hào)通路（P＜0.05），包括胃酸分泌、NF-κB信號(hào)通路、胰高血糖素信號(hào)通路、血管平滑肌收縮、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，見(jiàn)圖4。

圖3 DEGs的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs

圖4 DEGs的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用String數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)123個(gè)DEGs間的相互關(guān)系，以interaction score＞0.4為有效篩選條件，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化，從而構(gòu)建出由56條邊和50個(gè)節(jié)點(diǎn)組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，最具代表性的基因?yàn)镃DH2，連通度為9，見(jiàn)圖5。此外，通過(guò)Cyto-hubba插件對(duì)靶基因自由度計(jì)算得到Degree排在前10位關(guān)鍵差異基因，依次為CDH2、CD44、CXCL12、ACTA2、MYLK、S100A4、PLAU、NT5E、AXIN2、MYH10，見(jiàn)圖6。

圖5 關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.5 PPI network of hubgenes

圖6 Degree排在前10位的關(guān)鍵差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Degree ranked among top 10 hubgenes interaction networks

2.4 預(yù)測(cè)重要的miRNAs和mRNAs以TargetScan和miRDB靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)生成預(yù)測(cè)結(jié)果。從結(jié)果中預(yù)測(cè)到10個(gè)重要的miRNAs，包括：hsa-miR-4282、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-5582-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-449a。按MCC法排名，得出前10名靶基因mRNA分別為：ADAMTS5、ZIC1、HOXA5、MEOX2、LGR4、GAS1、TMEM35、STC2、TMEM30B、SLC9A9。miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖7。

圖7 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.7 miRNA-mRNA regulatory net-work

3 討論

MM-ASC與HD-ASC在分子表達(dá)上存在差異，但現(xiàn)有的在基因水平上的研究還不夠深入，故難以進(jìn)行MM的早期預(yù)測(cè)和靶向治療，因此課題組使用生物信息學(xué)方法探索GSE133346芯片數(shù)據(jù)集中MM-ASC的基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示，與HD-ASC相比，MM-ASC中存在123個(gè)DEGs，其中有上調(diào)基因36個(gè)，下調(diào)基因87個(gè)。GO和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，這些DEGs主要參與鈣化過(guò)程、鈣調(diào)素結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程和NF-κB信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路。

有文獻(xiàn)報(bào)道，與HD-ASC相比，MM-ASC向成骨細(xì)胞的分化存在缺陷，表現(xiàn)為鈣沉積減少、堿性磷酸酶活性降低、RUNX2和骨鈣素表達(dá)下調(diào)［3］。此外，細(xì)胞外高濃度的鈣離子刺激可激活Ca2+-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFATc3鈣信號(hào)通路，使MM患者過(guò)度分泌炎癥細(xì)胞因子和破骨細(xì)胞因子，進(jìn)而參與破骨細(xì)胞分化，加重MM［7］。這與本研究發(fā)現(xiàn)的MM-ASC的DEGs參與鈣化過(guò)程、鈣調(diào)素結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程和鈣信號(hào)通路的結(jié)果相一致。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，CDH2、CD44、CXCL12是MM-ASC的關(guān)鍵差異基因。CDH2基因在MM中過(guò)度表達(dá)，能編碼N-鈣黏蛋白［8］。研究表明，N-鈣黏蛋白在MM的生物學(xué)行為中發(fā)揮特定作用，如骨髓歸巢、成骨細(xì)胞相互作用。另外，N-鈣黏蛋白通過(guò)介導(dǎo)MM細(xì)胞與MSC間的黏附，從而阻止MM患者PC外滲及其在骨髓微環(huán)境中的定植，故MM-ASC中的CDH2基因可能是防止MM擴(kuò)散和延緩MM疾病惡化的一個(gè)可行的治療靶點(diǎn)［9-10］。

CD44是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是ASC表面的陽(yáng)性標(biāo)志物之一，其在相當(dāng)比例的MM患者樣本中高表達(dá)［11-12］。有研究表明CD44在癌細(xì)胞抗凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這些作用涉及Fas、caspase3/9、Bcl-xl/Bak、AKT、pRb、Bcl-2等多個(gè)分子的改變［13］。CD44過(guò)表達(dá)抑制了膜相關(guān)的E-鈣黏蛋白β-連環(huán)蛋白復(fù)合物的形成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)，而阻斷CD44信號(hào)通路可改善MM的預(yù)后［13-14］。另外，CD44v6作為一種CD44選擇性剪接變異體，在調(diào)節(jié)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。在MM中，大部分由骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生的骨橋蛋白（OPN）通過(guò)與CD44v6受體結(jié)合引起MM惡化［15］。有研究表明，CD44v6為MM細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)所必需，而沉默CD44v6可阻止MM，具有一定的抗腫瘤作用［16］。

內(nèi)穩(wěn)態(tài)/炎癥趨化因子CXCL12也稱SDF-1α，其可通過(guò)與表達(dá)于MM細(xì)胞表面的特異性受體CXCR4結(jié)合，調(diào)節(jié)MM的發(fā)展過(guò)程［17-18］。SDF-1與CXCR4的結(jié)合可激活三種MAPK通路（JNK通路、ERK1/2通路和P38通路）、PI3K/AKT通路、NF-κB通路、JAK/STAT通路。NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，而長(zhǎng)期或慢性炎癥促進(jìn)包括MM在內(nèi)的各種癌癥的發(fā)展［19］。與HD-ASC相比，MM-ASC成骨細(xì)胞分化存在缺陷，而研究表明TNF-α可通過(guò)激活NF-κB增強(qiáng)ASC的成骨分化作用［3，20］。此外，B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞可通過(guò)激活NF-κB來(lái)表達(dá)E-選擇素［21］。而E-選擇素在炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［22］。另有研究表明二甲雙胍可通過(guò)抑制NF-κB而抑制MM，為本課題組的研究提供了理論支持［23］。以上研究表明，NF-κB信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)ASC的成骨分化作用及調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)速度、腫瘤炎癥反應(yīng)，參與MM的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)有研究報(bào)道CXCL12在MM等血液惡性腫瘤中顯示出促腫瘤和促轉(zhuǎn)移作用［24］。抑制CXCL12可降低骨髓微環(huán)境的骨髓瘤支持活性，減少M(fèi)M細(xì)胞的歸巢和生長(zhǎng)，從而抑制MM疾病的進(jìn)展［25］。以上結(jié)果提示，通過(guò)靶向MM-ASC的CXCL12從而抑制NF-κB信號(hào)通路可能是破壞骨髓瘤間質(zhì)相互作用和抑制骨髓瘤生長(zhǎng)和存活的一種可行策略。

除前述的CDH2、CD44、CXCL12外，差異基因ACTA2、NT5E、S100A4的Degree值亦較大。ACTA2基因編碼的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMA），是血管平滑肌肌動(dòng)蛋白的一種異構(gòu)體，參與血管的收縮和運(yùn)動(dòng)。研究表明SMA在MM患者的成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加，可能有助于產(chǎn)生適合腫瘤生存的微環(huán)境［26］。NT5E（CD73）分子是一種表達(dá)于各種細(xì)胞表面的5'核苷酸酶，其產(chǎn)生的游離腺苷可抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。既往研究證實(shí)MM患者骨髓中腺苷水平明顯升高［27-28］。而通過(guò)抗CD73拮抗劑等阻斷腺苷途徑可成功靶向治療MM，是治療MM和其他血液病腫瘤的有效方案［29］。NT5E已被確認(rèn)為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)，可通過(guò)激活和抑制轉(zhuǎn)錄因子與miRNA共同作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)控制NT5E表達(dá)。但到目前為止，只發(fā)現(xiàn)較少的miRNAs如miR-422a可調(diào)控NT5E表達(dá)［30］。因此進(jìn)一步鑒定針對(duì)NT5E的miRNAs可能有助于研究MM中NT5E表達(dá)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。S100A4是S100家族蛋白的重要成員，其表達(dá)與多種腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)。已有研究證實(shí)S100A4是急性髓細(xì)胞性白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的新生物標(biāo)志物和重要的預(yù)后因素［31］，但目前尚不明確S100A4如何參與MM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其是否可能成為ASC中確定MM腫瘤轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探究。

miRNA是一種調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA分子，其通過(guò)靶向mRNAs并通過(guò)RNA干擾途徑觸發(fā)翻譯抑制或mRNA降解來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，在惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，可作為癌癥診斷和預(yù)后的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物［32-34］。一些針對(duì)MM的研究中已經(jīng)證實(shí)了miRNAs在腫瘤中的作用［35-36］。本研究的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果中得到了一些可能在MM發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用的miRNAs，可能成為MM-ASC的候選腫瘤生物標(biāo)志物。其中miR-30a-3p已被證實(shí)是一種腫瘤抑制因子，參與調(diào)控MM細(xì)胞的耐藥性，通過(guò)靶向miR-30a-3p的治療可能為MM細(xì)胞的耐藥治療提供新的視角［37］。金屬黏附素（MTDH）是一種致癌基因，其通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路在癌癥發(fā)生中發(fā)揮作用［38］。有研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性MM患者血清中miR-30d的表達(dá)明顯下調(diào)，該研究同時(shí)證實(shí)了miR-30d通過(guò)負(fù)調(diào)控MTDH抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，該結(jié)果顯示了miR-30d作為MM治療靶點(diǎn)的潛力。一些報(bào)道表明，差異表達(dá)的miR-34a參與MM的進(jìn)展［39-41］。進(jìn)一步研究表明miR-34a-5p可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因C-Myc發(fā)揮抗MM作用［42］。本研究結(jié)果顯示，miR-34a-5p可能是GAS1、TMEM35、LGR4、FAM162B等的共同調(diào)節(jié)因子，可以推測(cè)miR-34a-5p的差異表達(dá)可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)這些基因參與MM的發(fā)病過(guò)程，可能為MM的靶向治療及預(yù)測(cè)提供新的思路。此外，課題組還認(rèn)為SLC9A9、TMEM30B、ADAMTS5、ZIC1等可能是大多數(shù)miRNAs共同調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。以上結(jié)果表明，通過(guò)測(cè)定MM-ASC中miRNAs的表達(dá)及調(diào)控miRNAs水平可能有助于MM的診斷、預(yù)后和治療。

總的來(lái)說(shuō)，本研究通過(guò)對(duì)MM-ASC與HD-ASC進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CDH2、CD44、CXCL12等是與MM發(fā)病關(guān)系較為密切的關(guān)鍵靶基因，研發(fā)靶向調(diào)控CXCL12的藥物，從而抑制NF-κB信號(hào)通路可能是抑制MM進(jìn)展的重要方向。此外，課題組還發(fā)現(xiàn)miR-30a-3p、miR-34a-5p等miRNAs可能參與調(diào)控MM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究結(jié)果為今后MMASC的基礎(chǔ)研究與臨床診治提供新的思路，結(jié)合進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，以上參與MM發(fā)病的關(guān)鍵分子有望成為具有臨床價(jià)值的MM-ASC生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。