趙 丹 楊 祺 竇 科 薛智淞（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院，成都 610000）

腎癌是一種常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，病因尚不明確，可能與遺傳、吸煙、肥胖等因素有關(guān)［1］。腎癌患者早期一般無(wú)明顯癥狀，臨床主要采用手術(shù)切除治療，但尚缺乏有效的輔助治療方案來(lái)預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［2］。腎癌晚期患者可表現(xiàn)腰痛、血尿、貧血、體重減輕等，臨床主要采用以內(nèi)科治療為主的綜合治療措施，但晚期癌細(xì)胞對(duì)大多治療藥物的敏感性較低，預(yù)后較差［3］。尋找敏感的腎癌治療藥物，輔助臨床治療，降低術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，受到了研究者們的廣泛關(guān)注。紅景天（Rhodiola rosea）是我國(guó)傳統(tǒng)中藥的重要組成部分，紅景天苷（salidroside，SAL）是紅景天的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、減輕化療毒性等多種藥理學(xué)作用，已廣泛應(yīng)用于臨床心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、抗腫瘤等領(lǐng)域［4］。既往研究顯示，SAL可以抑制胃癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖活性，發(fā)揮抗腫瘤作用，但其對(duì)腎癌細(xì)胞的作用尚不明確，具體作用機(jī)制尚不清楚［5-7］。因此，本研究探討了SAL對(duì)腎癌細(xì)胞A498增殖、運(yùn)動(dòng)和免疫的影響，并進(jìn)一步分析了其可能的作用機(jī)制，旨在為腎癌的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料倒置顯微鏡（CKX41-A32PH）、熒光顯微鏡（BX-2）均購(gòu)自日本Olympus公司；A498細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；SAL購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，純度＞99%；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8檢測(cè)試劑盒、Transwell小室（包被Matrigel基底膜）均購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；IL-6、IL-10和TNF-α均購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；辣根過(guò)氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG、β-actin單克隆抗體、兔抗人上皮細(xì)胞鈣黏素（epithelial cadherin，E-cad）、神經(jīng)鈣黏素（nerve cadherin，N-cad）、波形蛋白（Vimentin）、IL-10、TNF-α、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204位點(diǎn)）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transduction and transcriptional activators 3，STAT3）、p-STAT3（Ser727位點(diǎn)）均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 SAL劑量的篩選采用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A498細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，隔天換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別于不同濃度的SAL（終濃度分別為0、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320μmol/L）孵育48 h，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，根據(jù)SAL作用濃度增殖曲線，計(jì)算半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50），設(shè)置SAL 0μmol/L組、SAL 10μmol/L組、SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組。

1.2.2 Transwell檢測(cè)A498細(xì)胞侵襲取各組與SAL孵育24 h的A498細(xì)胞，取100μl細(xì)胞以5×104個(gè)/孔加于Transwell上室（上室添加無(wú)血清的培養(yǎng)基，下室添加正常的培養(yǎng)液），培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛的進(jìn)行固定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%結(jié)晶紫的進(jìn)行染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)膜下室面表面細(xì)胞。

1.2.3 顯微鏡下觀察A498細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）取各組與SAL孵育24 h的A498細(xì)胞，正常培養(yǎng)5 d后，倒置于顯微鏡下，觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化，是否發(fā)生EMT。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中免疫炎癥因子水平取各組與SAL孵育24 h的A498細(xì)胞，離心（1 000 g，2 min），取上清，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10和TNF-α水平，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。

1.2.5 Western blot檢 測(cè)E-cad、N-cad、Vimentin、IL-10、TNF-α、ERK1/2和STAT3蛋白表達(dá)取各組與SAL孵育24 h的A498細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶封閉2 h，加一抗E-cad、N-cad、Vimentin、IL-10、TNF-α、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3（稀釋比例均為1∶1 000），以β-actin（1∶500）作為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記的IgG（1∶5 000），室溫下孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析各蛋白相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)ERK1/2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位取各組與SAL孵育24 h的A498細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加入200μl固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1），于4℃冰箱固定15 min，加含0.1%Triton X-100的PBS作用5 min，用含10%正常羊血清的PBS封閉30 min，加一抗p-ERK1/2（1∶100），4℃孵育過(guò)夜，加FITC標(biāo)記的二抗（1∶100），37℃孵育1 h，熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，滿足正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料均以±s表示，采用單因素方差分析組間差異性，SNK-q檢驗(yàn)比較組內(nèi)兩組間差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAL抑制A498細(xì)胞增殖CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），SAL對(duì)A498細(xì)胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性，IC50（23.41±2.45）μmol/L，因此設(shè)置SAL 0μmol/L組、SAL 10μmol/L組、SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組。隨著SAL濃度升高，A498細(xì)胞的存活率降低（P＜0.05）。

圖1 SAL抑制A498細(xì)胞增殖Fig.1 SAL inhibits proliferation of A498 cells

2.2 SAL抑制A498細(xì)胞侵襲Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），隨著SAL濃度升高，A498侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。

圖2 SAL抑制A498細(xì)胞侵襲Fig.2 SAL inhibits A498 cell invasion

2.3 SAL抑制A498細(xì)胞EMT及相關(guān)蛋白表達(dá)顯微鏡觀察結(jié)果顯示（圖3A），SAL 0μmol/L組和SAL 10μmol/L組細(xì)胞排列相對(duì)較疏松，部分細(xì)胞拉長(zhǎng)呈梭形，SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組細(xì)胞排列相對(duì)密集，細(xì)胞核皺縮變小。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3B），隨著SAL濃度升高，A498細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)升高，N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖3 SAL抑制A498細(xì)胞EMT及相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 SAL inhibited expression of EMT and related proteins in A498 cells

2.4 SAL抑制A498細(xì)胞免疫炎癥因子表達(dá)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4A），隨著SAL濃度升高，A498細(xì)胞上清中IL-6和TNF-α水平下降，IL-10水平升高（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4B），隨著SAL濃度升高，A498細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)下降，IL-10蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖4 SAL抑制A498細(xì)胞免疫炎癥因子表達(dá)Fig.4 SAL inhibited expression of immune inflammatory cytokines in A498 cells

2.5 SAL抑 制A498細(xì) 胞ERK1/2和STAT3的 活化Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示（圖5），隨著SAL濃 度 升 高，A498細(xì) 胞p-ERK1/2/ERK1/2和p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖5 SAL抑制A498細(xì)胞ERK1/2和STAT3的活化Fig.5 SAL inhibits activation of ERK1/2 and STAT3 in A498 cells

3 討論

腎癌早期無(wú)典型癥狀，初診時(shí)往往已發(fā)展至晚期，預(yù)后較差，臨床尚缺乏治療的特效藥物。中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，資源豐富，歷史悠久，近年來(lái)有研究從傳統(tǒng)中藥中篩選出了多種具有抗癌活性的藥物，并將其應(yīng)用于臨床，取得了一定的療效［8］。SAL是紅景天的主要活性成分，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，但其具體作用機(jī)制尚不清楚［9］。本研究探討了SAL對(duì)腎癌細(xì)胞A498增殖的影響，發(fā)現(xiàn)SAL對(duì)腎癌細(xì)胞A498增殖的抑制作用呈藥物濃度依賴性，且隨著SAL濃度升高，細(xì)胞存活率下降，提示SAL以藥物濃度依賴性的方式抑制腎癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究中，SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組A498細(xì)胞排列緊密，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于SAL 0μmol/L組，且隨著SAL濃度升高，E-cad蛋白表達(dá)升高，N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)下降。E-cad是一種鈣依賴性的上皮性標(biāo)記蛋白，主要分布于上皮組織，可以介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，其表達(dá)降低或缺失可以使細(xì)胞間黏附力降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT［10］。N-cad與E-cad的作用相反，N-cad高表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的黏附和遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［11］。Vimentin屬于中間絲蛋白家族，主要表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞，是細(xì)胞骨架的組成成分，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附功能，其表達(dá)陽(yáng)性是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志［12］。已有研究顯示，EMT是腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶向周圍或遠(yuǎn)處組織擴(kuò)散的基礎(chǔ)，在腫瘤的侵襲、遷移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，提示SAL可以調(diào)節(jié)腫瘤EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)換，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲［13］。腫瘤細(xì)胞的侵襲是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，也是影響患者預(yù)后死亡的主要因素，提示SAL可以抑制腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，改善患者預(yù)后［14］。

本研究中，隨著SAL濃度升高，細(xì)胞IL-6和TNF-α水平降低，IL-10水平升高。IL-6是一種多功能的免疫炎癥因子，可以刺激B細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，還可以誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)釋放，促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［15］。TNF-α主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可以激活炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL-6表達(dá)，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生成等，參與腫瘤的惡性進(jìn)展［16］。IL-10是細(xì)胞內(nèi)重要的免疫炎癥抑制因子，可以抑制IL-6、TNF-α的合成和分泌［17］。既往研究顯示，TNF-α還可以參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的ERK1/2、JAK/STAT、NF-κB等信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，介導(dǎo)腫瘤的惡性進(jìn)展［18-19］。LI等［20］研究顯示，SAL具有抗炎作用，可以抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路，抑制TNF-α誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，提示SAL可以抑制免疫炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)，抑制腎癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

本研究中，隨著SAL濃度升高，細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2和p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)降低。ERK1/2是一種細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，屬于MAPK家族，可以將細(xì)胞外信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和運(yùn)動(dòng)［21］。STAT3屬于STAT家族，可以與酪氨酸激酶（tyrosine kinas，JAK）組成JAK/STAT信號(hào)通路，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控腫瘤的炎癥、增殖和侵襲［22］。STAT3是ERK1/2的底物之一，ERK1/2磷酸化和核轉(zhuǎn)位可以激活STAT3，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、EMT等過(guò)程［23-24］。LV等［25］的研究顯示，SAL可以抑制STAT3的表達(dá)，抑制腎癌細(xì)胞的增殖，提示SAL可能通過(guò)抑制ERK1/2和STAT3的磷酸化，調(diào)控腎癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，SAL可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫炎癥因子表達(dá)，抑制腎癌細(xì)胞A498的增殖、侵襲和EMT，其作用機(jī)制可能與抑制ERK1/2和STAT3的磷酸化有關(guān)。但本研究?jī)H探討了SAL對(duì)腎癌細(xì)胞的作用及可能的機(jī)制，尚需大量的臨床前研究來(lái)驗(yàn)證。