劉芳坊 徐國(guó)亭 劉彥鋒 徐國(guó)興 李海中

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院麻醉與圍手術(shù)醫(yī)學(xué)科，南陽 473058）

原發(fā)性骨肉瘤是臨床較為罕見的一種惡性腫瘤，卻是骨腫瘤較常見類型之一，每百萬人中約有10例患者被確診，好發(fā)于青少年。骨肉瘤由間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來，具有較高轉(zhuǎn)移傾向性，因此患者預(yù)后較差，病死率較高［1-3］。盡管近年隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，新輔助化療方式引進(jìn)，使骨肉瘤患者五年生存率由20%提升至65%～75%，但由于化療耐藥現(xiàn)象普遍存在，加之部分化療藥物較嚴(yán)重的副作用，使骨肉瘤治療效果仍難以達(dá)到預(yù)期［4-6］。因此，尋找其他安全、有效的抗腫瘤藥物已成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，局麻藥物除已知的鎮(zhèn)痛、抗心律失常等作用外，還具有減少癌癥復(fù)發(fā)、提高生存率的作用。文獻(xiàn)顯示，羅哌卡因（ropivacaine，Rop）等局麻藥物在一定濃度范圍內(nèi)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索［7-8］。目前，有關(guān)Rop誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG-63自噬性死亡和促炎因子表達(dá)及其作用機(jī)制的研究較少，因此，本研究選擇骨肉瘤細(xì)胞MG-63為研究對(duì)象，觀察Rop對(duì)MG-63細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、自噬及促炎因子表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為骨肉瘤臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63購自中國(guó)科學(xué)院（上海）生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；Rop、10%FBS、DEME培養(yǎng)基購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑、Lipofectamine?2000試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司；Bradford蛋白定量試劑、Gimsa染色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自美國(guó)Millipore公司；Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Bender公司；辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG（ZB2301）購自北京中杉金橋公司；IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人骨肉瘤細(xì)胞MG-63培養(yǎng)于含10%滅活FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)，每2～3 d換液1次傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)與分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/L，接種于96孔板，邊緣孔加入適量無菌PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞單層鋪滿孔底。次日將培養(yǎng)好的MG-63細(xì)胞分為11組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別加入0、0.3、0.6、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L Rop溶液作用24 h，10μl/孔滴加CCK-8溶液，37℃恒溫孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處OD值，重復(fù)測(cè)定3次取平均值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-OD加藥組）/OD空白對(duì)照組×100%。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將MG-63細(xì)胞分為4組，分別加入0、0.5、1.0、2.0 mmol/L Rop溶液。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)將各組MG-63細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化、吹打成單細(xì)胞懸液，200個(gè)/皿分別接種于含37℃預(yù)溫培養(yǎng)液10 ml的培養(yǎng)皿，十字輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，37℃、5%CO2、飽和濕度常規(guī)靜置培養(yǎng)2～3周，肉眼觀察培養(yǎng)皿中出現(xiàn)可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄上清，PBS清洗2次，加入醋酸/甲醇溶液（1∶3）固定15 min，棄固定液，加入適量Gimsa染色液染色20 min，流水緩慢清洗，空氣干燥，計(jì)數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)，克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡調(diào)整各組MG-63細(xì)胞懸液至1×106個(gè)/ml，400μl/孔接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞至離心管，1 000 r/min離心5 min，PBS清洗2次，棄上清，加入試劑盒中緩沖液混勻，再加入5μl Annexin V-FITC/PI溶液混合，4℃避光孵育20 min，BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cell-Quest軟件分析計(jì)算細(xì)胞凋亡率，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.5 細(xì)胞自噬免疫熒光檢測(cè)調(diào)整MG-63細(xì)胞懸液密度至1×104個(gè)/ml，接種于6孔板，板內(nèi)放置蓋玻片，按照Lipofectamine?2000試劑盒說明將綠色熒光蛋白（EGFP）-LC3b質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，24 h后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥處理，孵育24 h，PBS清洗，Olympus-BX51熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況，計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞自噬點(diǎn)數(shù)量，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)提取培養(yǎng)24 h的各組MG-63細(xì)胞總蛋白，Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST漂洗充分后置于含5%脫脂牛奶的平皿中密封3 h，TBST再次漂洗備用。根據(jù)說明書推薦比例加入一抗4℃孵育過夜，次日取出PVDF膜，TBST漂洗3次，加入二抗室溫緩慢振蕩孵育1 h，洗膜，轉(zhuǎn)至ECL發(fā)光液，常規(guī)曝光顯影，Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，依據(jù)相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞IL-6、iNOS分泌收集培養(yǎng)24 h的各組MG-63細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用IL-6、iNOS ELISA試劑盒檢測(cè)各組MG-63細(xì)胞IL-6、iNOS分泌，按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 半定量RT-PCR檢測(cè)IL-6、iNOS mRNA表達(dá)提取培養(yǎng)24 h的各組MG-63細(xì)胞總RNA，NanoDropND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，留取符合實(shí)驗(yàn)要求（濃度≥50 ng/μl，A260/A280≥1.7）的RNA樣本用于RT-PCR檢測(cè)。以18S RNA基因?yàn)閮?nèi)參，分析IL-6、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)，以2-ΔΔCt表示。采用Primer Premier 5.0、DNAstar生物軟件分析IL-6、iNOS、18S RNA基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism與SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，至少進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Rop對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖抑制作用CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度Rop（0.3、0.6、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞24 h，Rop以劑量依賴方式抑制MG-63細(xì)胞增殖，當(dāng)Rop≥1 mmol/L時(shí)，其對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用（P＜0.05，圖1）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5 mmol/L Rop溶液處理MG63細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞克隆形成率與未處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而當(dāng)Rop溶液濃度達(dá)到1.0、2.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞克隆形成率與未處理組間相比明顯降低（P＜0.05，圖2）。

圖1 Rop抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖Fig.1 Rop inhibits proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

圖2 Rop對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Rop on proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

2.2 Rop誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡不同濃度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期和晚期細(xì)胞凋亡率之和，0.5 mmol/L Rop溶液處理MG-63細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡率與未處理組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而當(dāng)Rop濃度達(dá)到1.0、2.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率與未處理組間相比明顯升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 Rop誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡Fig.3 Rop induced apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells

2.3 Rop對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞自噬的影響不同濃度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)，0.5 mmol/L Rop溶液處理MG63細(xì)胞時(shí)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)與未處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)Rop達(dá)到1.0、2.0 mmol/L時(shí)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)與未處理組間相比明顯升高（P＜0.05，圖4）。轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白（EGFP）-LC3b質(zhì)粒后，未處理組僅在個(gè)別MG-63細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到微小點(diǎn)狀凝集熒光，未見明顯熒光顆粒形成；0.5 mmol/L Rop處理MG-63細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞自噬率與未處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)Rop達(dá)到1.0、2.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光顆粒明顯增多，細(xì)胞自噬率顯著升高（P＜0.05，圖5）。

圖4 Rop對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Rop on expressions of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin1 proteins in osteosarcoma MG-63 cells

圖5 Rop誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞自噬Fig.5 Rop induced autophagy of osteosarcoma MG-63 cells

2.4 Rop對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞促炎因子表達(dá)的影響RT-PCR及ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞24 h，0.5 mmol/L Rop處理MG63細(xì)胞時(shí)，IL-6、iNOS mRNA表達(dá)及IL-6、iNOS含量與未處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)Rop達(dá)到1.0、2.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞IL-6、iNOS mRNA表達(dá)及IL-6、iNOS分泌明顯降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 Rop抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞IL-6、iNOS分泌Fig.6 Rop inhibits IL-6 and iNOS secretions in osteosarcoma MG-63 cells

3 討論

近年麻醉鎮(zhèn)痛藥物和腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系引起研究者廣泛關(guān)注，多種局部麻醉劑對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的抗增殖、促凋亡作用已得到證明，而Rop作為臨床常用長(zhǎng)效酰胺類局麻藥物，其對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞自噬性死亡和促炎因子表達(dá)的影響尚未可知［9-10］。

姬寧寧等［11］報(bào)道，臨床相關(guān)濃度（7.5～30μg/ml）Rop能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖。本研究在骨肉瘤MG-63細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)論，CCK-8結(jié)果顯示，當(dāng)Rop≥1 mmol/L時(shí)，其對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，提示一定濃度Rop對(duì)MG-63細(xì)胞具有一定殺傷作用。本研究選取0、0.5、1.0、2.0 mmol/L 4個(gè)濃度用于對(duì)MG-63細(xì)胞增殖、凋亡及促炎因子表達(dá)影響的探究，克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未處理組比較，當(dāng)使用1.0、2.0 mmol/L Rop處理MG-63細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞克隆形成率明顯降低，提示Rop≥1 mmmol/L時(shí)，其對(duì)于MG-63細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用，與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

既往研究顯示，Rop不僅能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)其凋亡［12-14］。WANG等［15］發(fā)現(xiàn)，Rop＞1 mmol/L時(shí)能顯著抑制HCC細(xì)胞增殖，并可通過激活caspase-3表達(dá)促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡。本研究采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與未處理組比較，當(dāng)采用1.0、2.0 mmol/L Rop處理MG-63細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增高，提示Rop可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。

自噬指蛋白轉(zhuǎn)換過程中，起管家作用的物質(zhì)允許細(xì)胞清除多余蛋白或受損細(xì)胞器。研究認(rèn)為細(xì)胞自噬與神經(jīng)退行性疾病、肌肉疾病及癌癥等生理病理行為密切相關(guān)［16］。盡管多數(shù)人認(rèn)為自噬是機(jī)體在饑餓、低氧或細(xì)胞毒性作用等壓力性不利環(huán)境下，為提高細(xì)胞存活時(shí)間而出現(xiàn)的一種保護(hù)性機(jī)制，通過降解細(xì)胞中不需要或已損壞的大分子或細(xì)胞器，循環(huán)利用降解產(chǎn)物，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［17-18］。但近年研究發(fā)現(xiàn)，過度自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡［19-20］。目前常將自噬過程分為3個(gè)階段：①營(yíng)養(yǎng)缺乏、低氧等因素刺激下，自噬體膜脫落并形成杯狀雙層膜，包繞被降解物；②分隔膜漸漸延伸，完全包繞被降解的胞漿成分，形成自噬體；③溶酶體與自噬體結(jié)合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分，循環(huán)再利用［21］。LC3作為酵母ATG8基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞同源物，可靶向定位于自噬體膜，參與自噬形成過程［22］。LC3可分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型游離存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，Ⅰ型LC3被加工并與自噬膜表面磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成Ⅱ型LC3，后者始終位于胞內(nèi)實(shí)體膜上。自噬增強(qiáng)時(shí)，Ⅰ型LC3表達(dá)下降，而Ⅱ型LC3水平上升［23］。為驗(yàn)證Rop在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)有自噬參與，本研究通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)合蛋白LC3熒光顆粒情況，結(jié)果顯示，未經(jīng)處理組或0.5 mmol/L Rop處理組MG63細(xì)胞鮮有自噬發(fā)生，而經(jīng)更高濃度（1.0、2.0 mmol/L）Rop處理后細(xì)胞自噬率顯著升高，因此推測(cè)Rop誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡包含部分自噬性凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，本研究采用Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白Beclin1表達(dá)，并觀察自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化的比值，結(jié)果顯示，Beclin1蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯升高，證實(shí)Rop誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡形式中確實(shí)包含自噬性凋亡。

NO在動(dòng)物體內(nèi)既能作為細(xì)胞毒性分子，又可作為信息分子，具有損傷和保護(hù)雙重作用，主要由NO產(chǎn)生量決定；IL-6則是由多種免疫和非免疫細(xì)胞分泌的一種有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在機(jī)體存在炎癥反應(yīng)時(shí)誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成急性反應(yīng)蛋白，增強(qiáng)宿主自身破壞性炎癥。既往研究顯示，異氟醚等麻醉藥物可能通過減少炎癥細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子釋放減輕炎癥反應(yīng)［24-25］。目前Rop與促炎細(xì)胞因子表達(dá)的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，1.0、2.0 mmol/L Rop處理MG-63細(xì)胞，IL-6、iNOS mRNA表達(dá)及IL-6、iNOS含量明顯下降，提示一定濃度Rop可明顯下調(diào)MG-63細(xì)胞IL-6、iNOS mRNA表達(dá)，從而減少IL-6、iNOS分泌。

綜上所述，Rop對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞自噬性死亡，此外，Rop還能通過下調(diào)IL-6、iNOS mRNA表達(dá)減少IL-6、iNOS分泌。但本研究?jī)H初步探討了Rop對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞自噬性死亡和促炎因子表達(dá)的影響，MG-63細(xì)胞自噬性凋亡的靶點(diǎn)及具體信號(hào)分子途徑有待進(jìn)一步研究。