劉曉珺， 張 航， 宋娟娟， 呂信鵬， 杜雅菊， 鄧 穎

膿毒癥是機體對感染反應失衡而導致的危及生命的器官功能障礙。盡管膿毒癥發(fā)病機制的研究已取得重大進展，但紊亂的細胞信號轉導機制、難以控制的炎癥級聯(lián)反應以及導致機體嚴重障礙的能量代謝、免疫反應，使得其治療相對困難，因此，膿毒癥仍然是導致全球患者死亡的主要原因，也是重癥監(jiān)護室和急診科醫(yī)生最關注的急性綜合征之一[1]。細胞死亡可以在生長、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)、炎癥、免疫和各種病理生理過程中發(fā)揮極其重要的作用。壞死性凋亡(necroptosis)是一種新興的程序性細胞死亡形式，是對環(huán)境壓力的細胞反應，可由化學和機械損傷、炎癥等引起，具有與壞死相同的形態(tài)學變化，包括質膜完整性喪失、細胞質的透明化、細胞體積增加、細胞器腫脹、核脫氧核糖核酸(DNA)的聚集和降解等，但這種壞死又是可以調控的。越來越多證據(jù)[2]表明，壞死性凋亡是重要的細胞死亡形式，在病理生理學方面的作用備受重視，許多疾病被認為與其相關，如膿毒癥、神經(jīng)退行性疾病和缺血再灌注損傷等。本綜述旨在探討壞死性凋亡在膿毒癥中的研究進展。

1 壞死性凋亡

長期以來，有學者將細胞死亡歸屬為細胞凋亡和壞死兩種形式。20世紀80年代末，第一次揭示壞死可能也依賴于基因編碼機制[3]。2003年，Chan等[4]描述了一種受體相互作用蛋白激酶(RIP)介導的細胞死亡形式，與細胞凋亡不同，其依賴于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor， TNFR)、腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)和Fas。2005年，Degterev等[5]首次發(fā)現(xiàn)壞死素抑制劑(necrostatin-1, Nec-1)，是受體相互作用蛋白激酶-1(receptorinteracting protein kinase 1,RIP1；也被稱作RIPK1)的抑制劑，有力證實了這種壞死的可控性。2009年壞死性凋亡取得里程碑式的進展，確立了RIP1-RIP3在壞死性凋亡中的作用[6]。2012年，細胞死亡命名委員會(nomenclature committee on cell death, NCCD)建議將 “necroptosis”作為這種新型細胞死亡(調節(jié)性壞死)的一個特殊術語[7]。2018年，NCCD提議將“necroptosis”定義為主要是依賴于混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase-like， MLKL)、RIPK3和RIPK1激酶活性的細胞外或細胞內穩(wěn)態(tài)擾動引起的調節(jié)性細胞死亡[8]。

1.1壞死性凋亡的分子機制

RIPK1是壞死性凋亡途徑中第一個被識別的信號分子，但RIPK1是一種多功能信號激酶，可以觸發(fā)核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein, MAP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-8介導細胞凋亡等的激活，因此，RIPK1并不能準確用作壞死性凋亡激活的標記[9]。最近有研究[10]發(fā)現(xiàn)，RIPK3是決定細胞死于凋亡或壞死的分子開關，而不是RIPK1。RIPK1在缺乏RIPK3的情況下會驅動細胞凋亡，只有在RIPK3明顯表達的情況下才會觸發(fā)壞死。實驗[11]證明，RIP3(RIPK3)及其底物MLKL在壞死性凋亡中發(fā)揮專門的作用，這一調控途徑更加明確。

RIPK1是一種多結構域絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括N端激酶結構域、中間結構域、RIP同型作用(RHIM)結構域及包含6個α螺旋的C端死亡結構域(DD)。RIPK1結構域具有不同功能，即N末端調控激活NF-κB信號途徑，使細胞存活；RHIM則與RIPK3形成壞死小體參與調節(jié)程序性壞死；C末端結構域招募TNFRl而誘導凋亡。RIPK1啟動生存或死亡的不同途徑，由其泛素化、磷酸化和裂解狀態(tài)等決定。

壞死性凋亡是由廣泛的信號通路網(wǎng)絡誘導的，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、FasL和TRAIL、干擾素(interferons, IFNs)[12]、Toll 樣受體(toll-like receptors, TLRs)[13]及病毒介導的途徑等。目前，對 TNF-α介導的壞死性凋亡研究最為詳細[10]。TNF-α可與TNFR1或TNFR2兩個受體之一結合。若 TNF-α與受體TNFR1相結合，在胞內募集RIPK1、腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)、細胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， cIAPs)和轉化生長因子-β活化激酶-1(transforming growth factor-β-activated kinase-1, TAK-1)等信號分子聚集，并在胞膜上形成膜狀復合物Ⅰ[14]。cIAP1和cIAP2都是E3連接酶，引起復合物Ⅰ中蛋白質的多泛素化，RIPK1可作為連接信號分子的平臺(即IKK復合物)，進而激活NF-κB等炎癥途徑。隨后，復合物Ⅰ的修飾和內化使TNFR-1與復合物Ⅰ分離，釋放的RIPK1與caspase-8和Fas 相關死亡結構域蛋白(fas-associating death domain-containing protein， FADD)結合，形成細胞質復合物Ⅱ[15]。當 caspase-8被激活時，通過蛋白水解作用抑制RIPK1和RIPK3活性，形成復合物Ⅱa，誘導細胞發(fā)生凋亡；當 caspase-8 被抑制或其活性水平相對較低時，RIPK1和RIPK3不會被裂解，而是促進 RIPK1去泛素化，與RIPK3、FADD結合，并通過RHIM募集MLKL形成復合物Ⅱb，又稱為壞死體(necrosome)。體外實驗證明，壞死性凋亡嚴格依賴RIPK3激酶的活性，Ripk3-/-細胞和RIPK3抑制劑能明顯抑制壞死的發(fā)生。MLKL是激活RIPK3激酶依賴性壞死的門戶，MLKL的T357和S358位點磷酸化被激活，引起寡聚化和質膜易位。寡聚化的MLKL與磷脂酰肌醇磷酸酯結合，導致細胞膜破裂；質膜易位使鈣和鈉通量改變，膜通透性增加，離子內流，細胞內滲透壓升高，進而發(fā)生細胞死亡[16]。MLKL首先是在人類結腸腺癌HT-29細胞模型中被確認。MLKL基因進行選擇性剪接后產(chǎn)生兩種亞型，具有激酶結構域的較長剪接變異體導致TNF誘導的壞死。據(jù)文獻[17-18]報道，如果磷酸鹽結合P環(huán)缺陷，與對激酶活性所必需的關鍵氨基酸置換，MLKL將失去內在激酶活性。RIPK3下游的其他效應因子還包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(serine/threonine-protein phosphatase)、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶-Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK-Ⅱ)、磷酸甘油酸變位酶5(phosphoglycerate mutase 5, PGAM5)、動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)等。

1.2壞死性凋亡的病理生理學意義 壞死導致?lián)p傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)釋放，如炎癥反應的激活劑和調節(jié)劑白細胞介素(IL)-1α、IL-β、IL-33、高遷移率族蛋白1(HMGB1)等，這些因子的釋放促進Toll樣受體(toll-like receptors, TLR)、RIG-I樣受體(RIG-I-like receptors, RLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin recepto, CLRs)的激活，進一步誘導炎癥反應，以對抗和消除病原體。在免疫系統(tǒng)中，壞死性凋亡可以在T細胞發(fā)育過程中調節(jié)外周組織T細胞數(shù)量。對RIPK3/caspase-8和RIPK3/FADD雙敲除小鼠的研究[19]表明，RIPK3介導的壞死對于在發(fā)育過程中清除異常淋巴細胞是必須的。壞死的誘導可能還會促進腫瘤細胞的死亡和清除[20]。壞死性凋亡與壞死有類似的病理作用，如活性氧(ROS)的產(chǎn)生、線粒體膜超極化、溶酶體膜及細胞膜通透性增加等[21-23]。

2 壞死性凋亡在膿毒癥中的作用

越來越多實驗證實，壞死性凋亡可以導致機體各器官的急性或慢性損傷。壞死性凋亡被認為是新生兒缺氧缺血(hypoxia-ischemia, HI)腦損傷、創(chuàng)傷性腦損害、缺血及出血性腦卒中、肌萎縮性側索硬化癥以及神經(jīng)變性疾病的重要機制[24-30]。而在肺部相關疾病，如肺感染、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性肺損傷及肺癌中也有報道[31-32]。實驗[33-34]證明，Nec-1能夠減弱順鉑誘導的急性腎損傷(AKI)小鼠模型中腎形態(tài)的惡化，同樣對缺血再灌注導致的AKI也有保護作用。在急性心肌梗死、心臟缺血再灌注損傷、心臟移植、炎癥性腸病、腸道腫瘤、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、藥物性肝損傷、急性胰腺炎等疾病中，有廣泛實驗支持壞死性凋亡發(fā)揮了重要作用[35-41]。

2.1感染性疾病與壞死性凋亡 在感染性疾病發(fā)展過程中，致病微生物通過分泌各種毒力因子引起宿主感染或發(fā)生免疫逃離。壞死性凋亡已成為微生物感染中關鍵的細胞死亡反應。一方面，細胞通過該途徑消除病原體來增強自衛(wèi)；另一方面，壞死有助于細菌在宿主中傳播或增殖。大量細胞內容物的釋放會加劇周圍組織損傷，這與疾病的嚴重程度密切相關。因此，利用壞死性凋亡可調節(jié)性的特點，能夠有效緩解病原體對機體的損害和改善癥狀[42]。

2.1.1 病毒感染與壞死性凋亡 研究發(fā)現(xiàn)，痘病毒對caspase-8活性的抑制，可以為壞死性凋亡提供自然的啟動信號。缺乏RIPK1或RIPK3感染的牛痘病毒(vaccinia virus, VV)細胞，抑制了TNF誘導的壞死性凋亡的發(fā)生，Ripk3-/-小鼠和突變體無RIPK1激酶活性的D138N小鼠，都無法控制體內的VV復制[6]。E3L是VV編碼的免疫調節(jié)劑之一，它包含一個z-DNA結合域，而在哺乳動物RIPK3的受體同源相互作用蛋白結構域(RHIM)適配器中發(fā)現(xiàn)，有z-DNA結合蛋白1(z-DNA binding protein 1, ZBP1)的存在。E3L缺失的VV感染，導致ZBP1表達增加及IFN誘導的RIPK3/MLKL依賴性壞死的發(fā)生[43]。Ripk3-/-小鼠表現(xiàn)出對單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)的高度敏感性，因為HSV-1可以編碼和表達含有RHIM的ICP6蛋白，該蛋白直接與RIPK3結合，以激活壞死性凋亡。有研究[44]表明，ICP6缺失HSV-1，能夠在高劑量HSV-1長期感染后誘導RIPK3依賴性壞死。研究顯示，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)誘導的支氣管上皮細胞死亡與磷酸化的RIPK1和MLKL增加有關， RIPK1或MLKL的抑制，減弱了RSV的遷移和復制，降低了病毒載量[45]。甲型流感病毒(influenza a viruses, IAV)是壞死性凋亡的有效激活因子，ZBP1作為IAV感染的宿主蛋白，能夠激活RIPK3，并啟動細胞死亡信號。ZBP1-RIPK3細胞死亡信號系統(tǒng)是宿主防御IAV感染的重要途徑，野生型小鼠限制了IAV在感染肺部的傳播，并最終可以在感染10天內從肺組織清除，但Zbp1-/-或Ripk3-/-小鼠都不能抑制病毒的傳播，Zbp1-/-和Ripk3-/-小鼠中被感染的肺細胞成為了病毒的工廠，由于死亡信號受損的細胞不能阻止病毒復制，并迅速傳播到周圍未被感染的細胞，肺泡細胞廣泛受損，氣體交換障礙，最終導致呼吸衰竭。同時，Ripk3-/-小鼠的T細胞對受感染肺的浸潤也明顯減少，IAV特異性CD8細胞毒性T淋巴細胞(CTL)數(shù)在這些小鼠的肺部明顯減少，并且CTL不能像野生型小鼠那樣具有有效的功能[46-47]。在IAV感染期間，壞死樣凋亡也有不利的一面，表現(xiàn)為細胞壞死裂解，釋放大量炎癥介質，包括DNA本身，釋放到細胞外環(huán)境中，作為免疫細胞的信號，加重組織損傷，相比之下細胞凋亡是細胞的有序分解，形成的凋亡體可以有效的免疫沉默。小鼠特異性巨細胞病毒(mouse-specific murine cytomegalovirus, MCMV)已被證明與依賴于RHIMs的級聯(lián)相互作用的壞死性凋亡相關聯(lián)。MCMV表達M45蛋白，包含一個RHIM序列的N端無催化活性的核糖核苷酸還原酶結構域，該病毒RHIM序列的存在，可以抑制壞死性凋亡途徑[48]。寨卡病毒 (zika virus, ZIKV) 為一種蚊媒病毒，能感染人類并導致神經(jīng)系統(tǒng)損害。于ZIKV感染的星形膠質細胞中檢測到磷酸化的RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達增加，而RIPK3抑制劑GSK′872 預處理后，細胞死亡受到抑制，病毒復制明顯增加，這證明壞死性凋亡可能對星形膠質細胞中病毒復制具有保護作用，而用Nec-1抑制RIPK1沒有效果，這表明，ZIKV誘導的星形膠質細胞壞死性凋亡不依賴于RIPK1[49]。關于登革熱病毒(dengue virus, DENV)、腸道病毒、嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV-2)、新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)、禽流感病毒(H7N9)等感染的研究，都有壞死性凋亡參與發(fā)病的報道[50-52]。

2.1.2 細菌感染與壞死性凋亡 壞死性凋亡是細菌感染過程中誘發(fā)的較為關鍵的細胞死亡途徑。腸道病原性大腸桿菌(enteropathogenic escherichia coli, EPEC)可以合成和分泌大量免疫原性效應蛋白NleB1，它通過修飾FADD的精氨酸殘基和RIPK1死亡結構域來阻止細胞壞死，NleB1-/-防御性的EPEC無法于腸上皮細胞中繁殖，表明細菌誘導的壞死對生物體具有保護機制[53]。RIPK3的缺失導致宿主細胞對葉爾森氏菌敏感性增加，如果FADD或caspase-8同時被敲除，這些細胞對葉爾森氏菌可能會變得更加敏感[54]。在體外，鼠傷寒沙門氏菌導致感染的巨噬細胞發(fā)生RIPK1和RIPK3依賴的程序性細胞死亡，RIPK3敲除可明顯降低脾臟巨噬細胞的死亡，減少細菌數(shù)量，延長小鼠生存時間。此外，沙門氏菌還可以通過靶向RIPK1/3誘導微小RNA(miR)-155，增強巨噬細胞的壞死性凋亡[55]。成孔毒素(pore-forming toxin, PFT)是各種致病細菌中最常見的毒力因子，可引起細胞及細胞器膜通透性改變、離子穩(wěn)態(tài)失衡、三磷酸腺苷(ATP)及ROS的產(chǎn)生與代謝障礙。有學者[56]報道，黏質沙雷菌、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)、單核細胞性李斯特菌(listeria monocytogenes)、尿致病性大腸桿菌(uropathogenic escherichia coli, UPEC)和純化重組氣溶菌(purified recombinant pneumolysin)等產(chǎn)生PFT的細菌病原體，均能誘導巨噬細胞壞死，用RIP1、RIP3和MLKL抑制劑干預，起到預防巨噬細胞死亡的作用。金黃色葡萄球菌USA300菌株能引起嚴重肺炎，該菌株的毒力歸因于它表達了多種毒素，包括解整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)、Nod樣受體蛋白3(NLRP3)和白細胞分化抗原11b(CD11b)，實驗研究顯示，RIPK1/RIPK3/MLKL信號誘導的壞死性凋亡與金黃色葡萄球菌毒素產(chǎn)生高度相關，抑制RIPK10或MLKL，能減輕細胞毒性。MLKL抑制阻斷了caspase-1和IL-1β的產(chǎn)生，Rip3-/-小鼠的金黃色葡萄球菌清除率明顯改善，并且IL-6、TNF、IL-1α和IL-1β明顯降低，減少了炎癥反應[57]?；虮磉_分析顯示，RIPK3不僅在免疫細胞中大量表達，胃腸道尤其是小腸中也有大量表達。研究顯示，給Ripk3-/-小鼠口服單核細胞性李斯特菌后，可引起其有效傳播，并發(fā)全身感染，而在野生型小鼠中幾乎沒有觀察到傳播。令人驚訝的是，李斯特菌感染激活了RIPK3-MLKL通路，并未導致宿主細胞死亡，而是直接抑制了李斯特菌在細胞內復制[58]。結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)感染后，TNF-α的過度釋放會導致RIPK1/RIPK3/MLKL依賴性壞死信號通路的激活，產(chǎn)生大量ROS，以消除和控制巨噬細胞內MTB的生長和繁殖。但當細胞中壞死時，又導致細胞釋放細菌，因此，如何控制細胞內細菌的生長，防止被感染巨噬細胞的死亡和細胞外細菌的傳播，是控制MTB感染的關鍵[59]。

2.2膿毒癥與壞死性凋亡

2.2.1 肝損傷與壞死性凋亡 研究表明，壞死性凋亡在膿毒癥中起關鍵作用。RIPK1激酶活性缺陷的D138N/D138N小鼠，在全身炎癥反應綜合征(SIRS)中表現(xiàn)為對TNF或TNF/zVAD誘導的不敏感。有實驗證明，miR-425-5p作用于RIPK1，以降低RIPK1/RIPK3信號通路和炎癥反應，miR-425-5p的下調加重了脂多糖(LPS)誘導小鼠的肝損傷，但miR-425-5p的過表達則通過RIPK1抑制，對LPS誘導的壞死性凋亡和炎癥反應有保護作用。因此，有學者[60]提出，miR-425-5p/RIPK1軸能夠抑制壞死途徑，以保護膿毒癥小鼠的肝損傷。還有學者通過LPS誘發(fā)膿毒癥仔豬模型，并用Nec-1進行干預，觀察肝損傷中壞死性凋亡的情況，結果發(fā)現(xiàn)，無Nec-1干預組肝臟中壞死凋亡關鍵成分RIPK1、RIPK3和MLKL，線粒體蛋白PGAM5和DRP1，及細胞內損傷相關分子模式HMGB1，以時間依賴性方式增加，反映肝臟炎癥、形態(tài)損害和功能障礙的指標IL-1β、IL-6和TNF-α表達增多，血清谷草轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)活性升高。 Nec-1預處理后可明顯降低RIP1、RIP3、MLKL、PGAM5、DRP1和HMGB1的表達，明顯減輕肝臟炎癥和損害。因此得出結論，壞死性凋亡與膿毒癥肝損傷的發(fā)病機制有關，抑制壞死性凋亡途徑可能起到保護作用[61]。也有相反的報道，有學者在盲腸結扎膿毒癥大鼠模型肝臟組織中同樣觀察到壞死性凋亡的存在，RIPK1、RIPK3 和MLKL隨著時間的增加而高表達，但在肺和腎組織中沒有發(fā)現(xiàn)RIPK1、RIPK3 和MLKL的高表達。 經(jīng)Nec-1預處理后，肝臟組織各時間點RIPK1、RIPK3 及 MLKL的表達相應降低，抑制了壞死性凋亡。但有趣的是，該模型中大鼠的生存時間卻縮短，并導致肝功能和組織病理學進一步惡化。此外，發(fā)現(xiàn)B細胞淋巴瘤2相關X蛋白(Bax)/B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)比值增加，促進細胞色素C釋放，導致促凋亡分子caspase-3激活，caspase-8、caspase-9蛋白表達增加，從而加速了肝細胞凋亡。因此，作者推測壞死性凋亡對膿毒癥大鼠肝臟起到保護作用，其原因是壞死性凋亡阻斷了信號級聯(lián)反應的擴增，減輕細胞凋亡[62]。

2.2.2 心肌損傷與壞死性凋亡 許多膿毒癥患者內皮屏障功能受損。有研究表明，增強血管內皮細胞穩(wěn)定性和調節(jié)其對促炎細胞因子水平的反應，能明顯提高小鼠存活率。實驗[63]證明，經(jīng)TNF處理的Ripk1D138N / D138N小鼠的腸道或血管通透性沒有明顯增加，也沒有激活凝血級聯(lián)反應，但卻減少了內皮細胞壞死性凋亡的發(fā)生，從而為膿毒癥患者提供臨床益處。心臟功能障礙是膿毒癥主要死亡原因之一。研究[64]發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠心肌組織中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)的激活，降低了RIPK1、RIPK3和MLKL在心肌組織中的表達，減少促炎因子生成，從而減輕心臟炎癥，抑制壞死性凋亡，防止心肌功能障礙的發(fā)生、發(fā)展。

2.2.3 肺損傷與壞死性凋亡 在盲腸結扎誘導的膿毒癥小鼠幼崽模型中，血清IL-6、IL-1β 和IL-18 水平明顯增加，肺臟中IL-6、IL-1β、IL-18 mRNA水平亦增多，使用Nec-1處理后，這些炎癥因子及肺臟中mRNA的表達均下降，明顯改善了膿毒癥幼崽的肺組織學損傷評分，并將7天存活率從0升高至29%[65]。

2.2.4 腸損傷與壞死性凋亡 在LPS誘導的膿毒癥豬模型中，觀察到空腸細胞出現(xiàn)典型的壞死性凋亡，RIPK1、RIPK3、MLKL、PGAM5和HMGB1表達增加，血清及空腸炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6增多，同時伴有空腸形態(tài)的損害，以及消化和屏障功能降低。Nec-1可以抑制壞死性凋亡，RIPK1、RIPK3、MLKL、PGAM5、HMGB1蛋白表達下降，減少空腸形態(tài)損傷，并改善消化和屏障功能，同時還降低血清和空腸促炎細胞因子水平，以及空腸巨噬細胞和單核細胞數(shù)量。因此，Nec-1可能對膿毒癥腸損傷有預防作用[66]。

3 總結與展望

壞死性凋亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡形式，在生理條件下，壞死性凋亡是體內一種正常的程序性細胞死亡事件，通過基因調控，實施自殺保護措施，不僅能促進細胞的正常代謝，還能參與維持體內穩(wěn)態(tài)，清除體內非必要或病理細胞，以消除潛在的疾病危害。然而，在膿毒癥發(fā)病過程中，壞死性凋亡通過復雜的調控機制對機體起到保護或加重損害的作用，對不同組織及器官，在疾病的不同階段有著特殊影響。因此，進一步闡明壞死性凋亡在膿毒癥中的作用及其調控機制，不僅有助于對細胞死亡模式的深入理解，還將在壞死性凋亡相關靶點治療膿毒癥的選擇中發(fā)揮重要作用。