譚擁軍 裴超柱 程浩杰 卜會(huì)銅 譚桂湘 鄧?yán)?/p>

摘要：通過(guò)去溶劑化方法，將單體抗腫瘤多肽M1-21納米化，形成50 nm左右大小的多肽納米顆粒（Nano-M1-21）.運(yùn)用動(dòng)態(tài)光色散技術(shù)（DLS）和低壓透射電鏡（TEM）對(duì)Nano-M1- 21進(jìn)行表征，并進(jìn)行體外37℃條件下顆粒穩(wěn)定性測(cè)試，運(yùn)用乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和4T1細(xì)胞驗(yàn)證Nano-M1-21的抗腫瘤效果，結(jié)果表明Nano-M1-21更容易被細(xì)胞攝??；相比單體多肽，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的濃度更低.運(yùn)用小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞活體腫瘤移植模型，發(fā)現(xiàn)Nano-M1-21展示出良好的抑瘤效果.總之，單體肽M1-21經(jīng)納米劑型優(yōu)化后，有利于改善細(xì)胞的攝取，顯示出更好的抑瘤效果.

關(guān)鍵詞：M1-21；Nano-M1-21；納米化；抑瘤效果；多肽

中圖分類(lèi)號(hào)：Q784文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Desolution Optimization of Anti-tumor Peptide M1-21

TAN Yongjun，PEI Chaozhu，CHENG Haojie，BU Huitong，TAN Guixiang，DENG Lei

（College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract：The anti-tumor peptide M1-21 monomer was used to create nanoparticles（Nano-M1-21，about 50 nm）by the desolution method. The characteristics of Nano-M1-21 were determined by the dynamic optical dispersion （DLS）and the low pressure transmission electron microscopy （TEM）. The stability of Nano-M1-21 particles was measured in vitro at 37 degrees centigrade. To verify the anti-tumor effects of Nano-M1-21，we used breast cancer MDA-MB-231，MCF-7 and 4T1 cells to show that Nano-M1-21 was easily absorbed by the cells and its tumor inhibitory concentration was lower than that of monomer peptide. With a mouse breast cancer 4T1 cell-grafting tumor model，we found that Nano-M1-21 showed a good suppressive effect on the tumors. In conclusion，compared to the monomer peptide M1-21，the optimized Nano-M1-21 nanoparticles provide benefits to improve the cellular uptake and anti-tumor effects.

Key words：M1-21；Nano-M 1-21；nanoization；antitumor effect；peptides

自1920年胰島素療法問(wèn)世以來(lái)，多肽藥物以持續(xù)穩(wěn)定的速度進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)[1].天然多肽由于較差的化學(xué)和物理穩(wěn)定性以及較短的血漿半衰期，通常不適合直接用于治療，已經(jīng)利用許多化學(xué)的修飾的方法，或增強(qiáng)肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)（即折疊）來(lái)防止被蛋白水解酶降解，從而改善多肽藥物的體內(nèi)半衰期[2-5].

多肽可自組裝成不同的結(jié)構(gòu)，包括納米管、納米球、納米線和納米纖維[6].這些有序納米結(jié)構(gòu)的形成與各種分子間非共價(jià)相互作用的協(xié)同效應(yīng)有關(guān)，包括氫鍵、π-π堆積、靜電、疏水和范德華相互作用[7].自組裝球形肽（NPs）直徑小于100 nm，由于易被細(xì)胞吸收特別適合生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.NPs還可以在自組裝過(guò)程中將疏水性藥物加載到其內(nèi)核中，從而使其成為藥物遞送系統(tǒng)的理想候選藥物[8-9].較小的顆粒（<100 nm）避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）立即清除，而較大的顆粒（>250 nm）通過(guò)吞噬作用和腎臟的天然過(guò)濾系統(tǒng)迅速清除[10].腫瘤血管系統(tǒng)的高滲透性允許大分子和納米顆粒進(jìn)入腫瘤間質(zhì)空間，這種自發(fā)性積累或“被動(dòng)”靶向作用被稱為增強(qiáng)的通透性和保留（EPR）效應(yīng)，EPR效應(yīng)介導(dǎo)的藥物遞送目前被認(rèn)為是將藥物引入腫瘤的有效方法，特別是大分子藥物和載有藥物的藥物納米載體[11-12].

本課題組篩選出了一種來(lái)源于FOXM1的抗腫瘤多肽M1-21（專(zhuān)利號(hào)：CN108440671B），已經(jīng)展現(xiàn)出抗腫瘤效果[13]，具體的藥理機(jī)制已經(jīng)完成正在投稿中.我們通過(guò)去溶劑化的方式，使抗腫瘤多肽M1- 21自組裝形成一定大小的納米顆粒，增強(qiáng)了多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不易被水解酶快速降解，并且Nano-M1- 21可通過(guò)EPR效應(yīng)在腫瘤組織部位富集，更好地發(fā)揮抗腫瘤的效果.

1材料與方法

1.1材料

二氯樹(shù)脂、氨基酸購(gòu)于希施生物科技有限公司，DMF、PIP、DIEA、HBTU、DCM、TFA、EDT、YIS、無(wú)水乙酷、乙腈（色譜級(jí)）、無(wú)水乙醇、甲醇、異丙醇、吡啶等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO公司，胎牛血清（FBS）為Hyclone公司產(chǎn)品，乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、4T1細(xì)胞購(gòu)自TACC，臺(tái)盼藍(lán)、FITC、BCA試劑盒購(gòu)自生工生物工程有限公司，balb/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司.

1.2方法

1.2.1設(shè)置程序進(jìn)行多肽M1-21的合成以及純化、鑒定、標(biāo)記

利用全自動(dòng)多肽合成儀合成多肽M1-21[圖2（a）]，合成的多肽粗品在蛋白純化儀上使用C18柱反向?qū)游鲞M(jìn)行純化，流動(dòng)相分別是水（0.05%TFA）和乙月青（0.05%TFA），乙月青上升洗脫.先對(duì)純化出的多肽進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，再用高效液相色譜儀對(duì)純化的多肽M1-21進(jìn)行純度檢測(cè)，采用C18柱反向?qū)游鲞M(jìn)行，流動(dòng)相分別是水（0.05%TFA）和乙腈（0.05%TFA），乙腈上升洗脫，最后軟件積分求出峰面積百分比.用過(guò)量摩爾比的FITC對(duì)多肽進(jìn)行標(biāo)記，F(xiàn)ITC粉末溶于Py：DMF：DCM=12：7：5的混合溶液中，再與連有多肽的二氯樹(shù)脂混合反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后用DMF、異丙醇、DCM，先后各洗兩遍，再用切割液將標(biāo)記好的多肽切割下來(lái)，用9倍體積乙醚進(jìn)行沉淀，凍干.

1.2.2單體M1-21去溶劑化形成Nano-M1-21及表征

10 mg的多肽M1-21溶于1 mL的1*PBS中，取100 μL于反應(yīng)瓶中，置于磁力加熱攪拌器上（600 r/min，25 ℃）攪拌，以1 mL/min的流速加入4倍體積的無(wú)水乙醇，持續(xù)攪拌20 min，18 000 g離心收集沉淀，用PBS清洗沉淀，去上清，再用PBS超聲重懸Nano- M1-21.最后用BCA試劑盒測(cè)量Nano-M1-21的濃度（圖1）.動(dòng)態(tài)光色散（DLS）儀測(cè)量納米顆粒流體動(dòng)力學(xué)直徑及其分布.取10 μL乙酸鈾染色的Nano-M1-21懸浮液滴吸附在碳涂層的300目銅網(wǎng)上5 min，然后用濾紙除去殘留的液體，干燥，再進(jìn)行TEM觀察.

1.2.3Nano-M1-21細(xì)胞水平效果驗(yàn)證

將MCF-7、MDA-MB-231、4T1乳腺癌細(xì)胞鋪到24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM的濃度分別加入M1-21、Nano-M1- 21，36h后去上清加入0.04%的臺(tái)盼藍(lán)溶液處理3～5 min，去除臺(tái)盼藍(lán)溶液并用PBS清洗兩遍，顯微鏡下拍照，再進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù).按照上述方法，將FITC標(biāo)記的M1-21與未標(biāo)記的多肽按1：9的比例混合制備帶熒光的Nano-M1-21，按照前面相同的方法測(cè)量濃度以及表征.再按30μM的濃度加入到MCF-7，MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中處理2 h，然后觀察熒光判斷M1-21、Nano-M1-21進(jìn)入細(xì)胞的情況.

1.2.4Nano-M1-21動(dòng)物水平效果驗(yàn)證

狀態(tài)較好的balb/c小鼠，年齡達(dá)到6周后，皮下接種5×10個(gè)4T1乳腺癌細(xì)胞建立皮下實(shí)體瘤模型.3 d 后，M1-21，Nano-M1-21分別以25 mg/kg的劑量尾靜脈給藥，隔天給藥一次，并對(duì)小鼠體重和腫瘤大小進(jìn)行測(cè)量.

2結(jié)果

2.1多肽M1-21的合成與鑒定

為了檢測(cè)多肽合成的質(zhì)量，我們通過(guò)質(zhì)譜分析多肽M1-21［圖2（a）］，質(zhì)譜結(jié)果顯示［圖2（b）］在3560處有明顯峰圖，與M1-21相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明多肽M1-21合成成功，并且高效液相色譜檢測(cè)純化后的M1-21濃度高達(dá)96.161%［圖2（c）］.

2.2Nano-M1-21的制備與表征

單體多肽M1-21通過(guò)去溶劑化自組裝形成納米顆粒（圖1），TEM和DLS的結(jié)果顯示納米顆粒大小均勻地分布在50 nm左右［圖3（a）（b）］.體外37 ℃穩(wěn)定性測(cè)試（DLS檢測(cè)）可知，24h后納米顆粒的大小主要分布在45 nm左右，48 h后大小主要分布在27 nm 左右，8 d后納米顆粒大小一直維持在27 nm左右［圖3（c）］，說(shuō)明納米顆粒在37 ℃下具有比較好的穩(wěn)定性，不會(huì)完全解聚為單體.

2.3細(xì)胞水平上Nano-M1-21能更好地抑制腫瘤細(xì)胞的活力

為了驗(yàn)證Nano-M1-21的效果，在MDA-MB- 231、MCF-7、4T1乳腺癌細(xì)胞中，將M1-21和Nano- M1-21按濃度梯度分別加入這三種腫瘤細(xì)胞中，36 h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色后活細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，Nano-M1-21達(dá)到和M1-21單體多肽相同的效果所需的量更少. 在MDA-MB-231，MCF-7和4T1細(xì)胞中，相對(duì)于M1- 21，Nano-M1-21的IC50分別減少1.53倍、3.37倍以及1.5倍（見(jiàn)圖4）.

2.4Nano-M1-21更易于被細(xì)胞吸收

按照前面去溶劑的方法，將FITC標(biāo)記的M1-21和未標(biāo)記的M1-21按1：9混合制備了帶熒光的Nano-M1-21，DLS和TEM表征發(fā)現(xiàn)，顆粒大小均勻分布在50 nm左右［圖5（a）（b）］.在MDA-MB-231、MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，熒光圖[圖5（c）（d）]乳可知Nano-M1-21更易于被細(xì)胞吸收，可能由于納米化后改變了細(xì)胞對(duì)M1-21的攝取方式，明場(chǎng)細(xì)胞圖發(fā)現(xiàn)Nano-M1-21組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變.

2.5Nano-M1-21明顯抑制balb/c荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)

在balb/c小鼠皮下實(shí)體瘤模型中，通過(guò)隔天尾靜脈給藥進(jìn)行治療，給藥過(guò)程中[圖6（a）]，小鼠體重沒(méi)有發(fā)生明顯變化[圖6（b）]，Nano-M1-21比起M1-21 單體肽展現(xiàn)出更好的抑瘤效果[圖6（c）]，治療結(jié)束后，將小鼠處死，取出每組皮下瘤觀察大小[圖6（d）]并稱量瘤子的質(zhì)量[圖6（e）]，這些結(jié)果都表明，在小鼠腫瘤模型中Nano-M1-21有更好的抑瘤效果.

3討論

肽類(lèi)藥物給藥后可能受到蛋白水解酶降解或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而受到限制，所以將多肽充分遞送至腫瘤部位是具有挑戰(zhàn)性的[14].因此，部分肽類(lèi)藥物需要改進(jìn)其遞送方式以成功開(kāi)發(fā)出抗癌肽.藥物遞送研究的基本目標(biāo)是通過(guò)改善治療分子的遞送來(lái)提高治療分子的功效.制劑、控釋、遞送途徑和保存期限的改進(jìn)大大提高了治療效果[15-19].納米顆粒已被用于改善小分子抗癌藥（例如阿霉素和紫杉醇）的藥代動(dòng)力學(xué)特性和治療效果[20].通過(guò)這種方式，納米顆粒具有通過(guò)增強(qiáng)滲透和保留（EPR）效應(yīng)在腫瘤微環(huán)境中維持藥物暴露的能力[21].另外，可以用與腫瘤細(xì)胞表面特異性的靶標(biāo)結(jié)合的配體來(lái)修飾納米顆粒[22]，從而達(dá)到抗癌藥物靶向腫瘤治療的效果.

因此，我們?cè)诰哂锌鼓[瘤效果的多肽M1-21的基礎(chǔ)上，通過(guò)去溶劑化的方式，使單體多肽分子間在疏水力的相互作用下自組裝形成50 nm左右的多肽納米顆粒.納米化后，細(xì)胞對(duì)顆粒物質(zhì)進(jìn)行胞吞，納米顆粒的大小會(huì)影響它與細(xì)胞膜的相互作用，并最終影響細(xì)胞內(nèi)吸收，直徑約50 nm的納米顆粒通常更容易被細(xì)胞吸收[23]，因此M1-21單體多肽通過(guò)納米化后易于被細(xì)胞吸收，改善了多肽對(duì)于腫瘤的抑制效果.而自組裝方法可用于治療性肽藥物的劑型改造，以改善其穩(wěn)定性和治療活性，從而開(kāi)發(fā)無(wú)載體的藥物遞送系統(tǒng).在本次研究中，Nano-M1-21在小鼠腫瘤模型中取得了比較好的抗腫瘤活性，但Nano-M1-21通過(guò)EPR效應(yīng)在腫瘤部位的富集以及延長(zhǎng)其代謝周期還需進(jìn)一步驗(yàn)證.除了通過(guò)M1-21本身自組裝形成納米顆粒完成遞送外，還可嘗試其他可自組裝的兩親性材料（脂質(zhì)體等）來(lái)完成多肽M1-21的遞送，這兩種方法往往只是EPR效應(yīng)的被動(dòng)靶向.想要取得更好的靶向效果，可以考慮采用主動(dòng)靶向的策略，在納米粒子表面直接修飾與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的受體定向結(jié)合的配體（iRGD）來(lái)靶向腫瘤細(xì)胞.因此，多肽M1-21可嘗試結(jié)合被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向的優(yōu)化策略，達(dá)到更好的抑瘤效果.

最后，多肽在自組裝過(guò)程中可將疏水性藥物（紫杉醇，阿霉素）載入其疏水內(nèi)核[9]，那么我們的多肽M1-21成為藥物遞送系統(tǒng)的理想候選藥物的同時(shí)也可聯(lián)合其他藥物共同治療腫瘤.一種重組蛋白（四聚體M2e）可通過(guò)去溶劑化先形成納米粒子核心，然后在其表面交聯(lián)抗原肽（HA），這種納米顆粒疫苗可誘導(dǎo)持久且強(qiáng)大的免疫力[24]，所以Nano-M1-21可成為有效抗原的載體，進(jìn)入體內(nèi)關(guān)鍵區(qū)域誘導(dǎo)免疫反應(yīng).

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